蛋白质与生物大分子的相互作用研究.ppt

蛋白质与生物大分子的相互作用研究
张雪梅
apoe@
检验医学院
基因的功能研究成为热点,研究的对象即为基因编码的产物—蛋白质,生物功能的主要体现者和执行者。
在所有生命活动中,细胞接受外源或是内源的信号,通过其特有的信号途径,调节其基因的表达,以保持其生物学特性,这其中必须涉及蛋白与蛋白、核酸的相互作用。
掌握或发明研究相互作用的方法非常重要。
nucleus
cytoplasm
主要内容
免疫共沉淀(Co-IP):蛋白—蛋白,蛋白—DNA
Pulldown(亲和层析):蛋白—蛋白,蛋白—DNA/RNA
电泳迁移实验(EMSA):蛋白—DNA/RNA
酵母双杂交系统:蛋白—(X)—蛋白
用途:
鉴定两种目标蛋白质是否在体内结合,结合位点分析;
筛选一种特定蛋白质的新的作用搭档。
原理:
当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x,那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。
一、免疫共沉淀(in vivo)
Co-Immunoprecipitation,Co-IP
Co-IP鉴定蛋白相互作用
实验注意事项
细胞裂解采用温和的裂解条件(NP40、Triton-X100等);每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验摸索确定。
确保共沉淀的蛋白是由所加入的特异性抗体沉淀得到的,而并非其他非特异蛋白:
1、使用单克隆抗体:多抗?
2、使用对照样本或抗体(同型抗体)
Structural basis of G protein–coupled receptor–G protein interactions。Nature Chem Biol, 2010, 6: 541-548(分析蛋白相互作用的位点)
大鼠G蛋白耦联受体M3R
G蛋白α(绿色)β(蓝色)γ(紫色)亚基
G蛋白藕联受体信号转导示意图