第9章 核酸分子杂交技术与应用.ppt

第九章核酸分子杂交技术与应用
李建平
第一节核酸分子杂交的基本原理与分类
定义:单链核酸分子在合适的温度和离子强度下,通过碱基互补形成双链杂交体(hybrid)的一类技术,称作核酸分子杂交。
一、核酸分子杂交的基本原理
变性:融解,双螺旋氢键断裂,形成单链;
复性:单链探针与靶DNA单链之间形成杂合体DNA(异源核酸分子),即为核酸杂交。
二、核酸分子杂交分类
(一)按分子: DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA杂交
(二)按标记: 同位素与非同位素杂交
(三)按介质: 液相杂交、固相杂交、原位杂交
(四)基因芯片技术
固相杂交
1、菌落杂交:筛选重组菌落
2、Southern杂交:(靶核酸是DNA)
3、Northern杂交:(靶核酸是RNA)
4、点杂交和狭缝杂交
原位杂交:
切片组织细胞中基因定位.
二、短小寡核苷酸探针杂交
(一)影响杂交稳定性的因素:
1、融解温度(Tm): 50%杂化核酸分子解链温度。
(***盐、碱基错配比例)
2、盐浓度
(二)杂交时间: 依复杂性,一种或多种探针
(三)杂交加速剂: 一般不用
(四)洗脱条件
(五)杂交条件的优化:杂交或洗脱温度盐浓度
第三节探针的设计(1)
一、探针的种类:
DNA、RNA、寡核苷酸探针
(一)DNA探针:单链、双链不易被降解
(二)RNA探针:效率高、易被降解
(三)寡核苷酸(ASO)探针:可大量合成
第三节探针的设计(2)
二、探针标记方法的选择:
●放射性标记:32P
●非放射性标记:生物素、***、荧光素
三、探针的长度:
●DNA、RNA探针:400-500bp
●寡核苷酸探针长度:F=(1/4)L×2N 。
第四节核酸分子与固相介质的结合
一、支持介质的类型:
***纤维素薄膜(NC)、尼龙膜等。
二、靶核酸分子的转移:
1、从克隆菌落转移DNA
2、从凝胶胶上转移DNA
●毛细转移: 毛细管虹吸(Southern印迹)
●真空转移:
三、核酸的固定:
烘烤、紫外光固定、碱固定。