ILKsiRNADNA表达载体的构建论文.doc

ILKsiRNADNA表达载体的构建论文.docILKsiRNADNA表达载体的构建论文
李敏侠,刘必成,张露,张晓良
摘要目的:构建针对整合素连接激酶(ILK)mRNA的小干扰RNA(siRNA)表达载体,为抑制ILK在哺乳动物细胞内表达、研究其功能奠定基础。方法:合成含靶向ILK基因siRNA转录模板的茎环结构,与两端分别有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的Psilencer ,大肠杆菌中扩增,测序鉴定。结果:转化大肠杆菌涂布平板长出阳性菌落,重组质粒电泳初步说明质粒构建成功,测序结果表明Psilencer Ⅰ、HindⅢ之间有64 interfering RNA,siRNA)技术阻断特定基因的表达以来,RNA干扰(RNA interference,RNAi)已发展成为一种经济、快捷、高效抑制基因表达的有力工具。siRNA是一种19个碱基互补配对、两端分别有两个碱基突出的2123nt的双链RNA,可以与细胞内核酶形成RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silence plex,RISC)。在其中一条RNA链的引导下,RISC特异性降解与siRNA同源的mRNA2。siRNA制备方法有多种,各有其优缺点,但若是在哺乳动物细胞内持续稳定表达siRNA,长久抑制靶基因,以小的茎环结构RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体的方法和稳定筛选的技术最为有效34。整合素连接激酶(integrin linked kinase,ILK)是Hannigan等5于1996年首先发现的一种能与整合素结合的具有452个氨基酸残基的Ser/Thr蛋白激酶。有研究表明,ILK在肾小管上皮细胞间充质转分化(epithelialmesenchymal transition,EMT)中发挥了重要作用6。本研究拟构建一个ILKsiRNA表达载体,用此载体转染肾小管上皮细胞株,为应用RNAi技术抑制ILK表达,进一步研究ILK在肾小管EMT中的作用提供物质基础和技术支持。
1 材料与方法
材料Psilencer H1 Hygro 即用型线性质粒购自Ambion公司,全长4 552 bp,两端分别带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点,并且带有潮霉素(hygomycin)和氨卞青霉素(ampicillin)抗性,适合进行稳定筛选。T4 DNA连接酶和质粒提取试剂盒购自大连TaKaRa公司。菌株JMα由东南大学黏细菌发育研究室惠赠。ILKsiRNA转录模板7由上海申能***公司合成,RNAi ILK目标序列为5′TGACGAAGCTCAACGAGAA3′。
方法
茎环结构的设计所设计茎环结构序列长度为64 bp的反向重复序列,.freelHⅠ、HindⅢ酶切位点,中间被9 bp环结构分割。并以6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子,形成BamHⅠ+Sense+Loop+Antisense +终止信号+Hind
Ⅲ的结构。序列如下:正义链,5′GTGACGAAGCTCAACGAGAATTCAAGAGATTCTCGTTGAGCTTCGTCATTTTTTGGAAA3′;反义链,3′TTTTCGA5′。
单链ILKsiRNA转录模板退火变成双链将合成的单链正义siRNA转