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微生物的分离与纯化
一、实验意义和目的
自然界中各种微生物混杂着生活在一起,即使取得少量的样品也是许多微生物共存的群体。微生物的纯培养是指培养物中所有的细胞只有该微生物的某一种或者某一株,它们有着共同的来源,是同一细胞的后代。在进行某种微生物的分类鉴定、生理生化特性的研究工作时,首先须使该微生物处于纯培养状态。从混杂的微生物群体中获得纯培养的过程称为微生物的分离与纯化(Isolation and Purification of anisms),该技术是微生物研究的基本操作技术之一。
通过本实验,要求达到以下目的:
(1)理解微生物的分离与纯化技术在微生物研究中的重要性。
(2)掌握几种常用的分离、纯化微生物的操作技术。
二、实验原理
微生物的分离与纯化是指从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程。将特定的微生物个体从群体中或从混杂的微生物群体中分离出来的技术称为微生物的分离。在特定环境中只让一种或者一株来自同一祖先的微生物生存的技术称为微生物的纯化。常用的方法有如下几种。

该方法采用很细的毛细管吸取较稀的萌发的孢子悬液滴在培养皿盖的内壁上,在普通显微镜的低倍镜下逐个检查微滴,将只含有一个萌发孢子的微滴放一小块营养琼脂,使其发育成微菌落。再将微菌落转移到培养基中,即可获得仅有单个孢子发育而成的纯培养。

该方法操作简便,普遍用于微生物的分离和纯化。其基本原理包含两方面:
(1)稀释技术:通过稀释涂布平板和平板划线挑取单个菌落,从而获得纯培养。
(2)选择培养技术:如果所要分离的微生物在混杂的微生物群体中数量极少或者增殖过慢而难以稀释分离时,需要结合使用选择培养法,即选用仅适合于所要分离的微生物生长繁殖的特殊培养条件(如营养、酸碱度、温度和氧气等)来培养混杂菌体,改变群体中各类微生物的比例,以达到分离的目的。
但是,从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此,纯培养的确定除观察其菌落特征外,还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定。
三、实验仪器和试剂

(1)玻璃培养皿:直径9 cm。
(2)玻璃涂布棒。
(3)血细胞计数板。
(4)普通光学显微镜。
(5)移液器及吸头:1 mL,5 mL。
(6)摇床:200 转/分钟。
(7)试管:20 mL。
(8)三角瓶:250 mL。
(9)洁净操作台:洁净度为ISO 5(100级)。
(10)其他:电子天平、量筒、容量瓶、接种环等。

(1)酚溶液(10%):量取10 mL酚加入到100 mL容量瓶,用去离子水定容至100ml。
(2)链霉素溶液(50 mg/mL):称取链霉素50 mg溶于1 mL无菌水中。

(1)高氏一号琼脂培养基(淀粉琼脂培养基)
(2)牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
(3)马丁氏琼脂培养基
四、实验方法和步骤

(1)倒平板
将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏一号琼脂培养基和马丁氏琼脂培养基加热融化,待冷却至55~60 ºC时,在高氏一号琼脂培养基中加入10%酚数滴,马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液(终浓度为50 mg/mL),混均匀后分别倒平板,每种培养基倒3皿。
-1 倒平板操作图
倒平板的方法:右手持装有琼脂培养基的三角瓶置于火焰旁边,用左手将三角瓶塞轻轻地拔出,瓶口保持对着火焰,然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住瓶塞(如果三角瓶内培养基一次用完,瓶塞则不必夹在手中)。左手拿培养皿并将皿盖在火焰旁边打开一缝,迅速倒入培养基约15 mL(-1),盖好后轻轻摇动培养皿,使培养基均匀分布在培养皿底部,然后置于水平桌面上,待培养基凝后即为平板。
(2)制备土壤稀释液
称取土样10 g,放入盛有90 mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中,200 转/分钟振荡20 min,使土样和水充分混合。使用无菌吸头吸取1 mL土壤悬液加入盛有9 mL无菌水的试管中充分混匀,然后从此试管中吸取1 mL溶液加入到另一盛有9 mL无菌水的试管中,混合均匀。以此类推从而得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的土壤溶液。
(3)涂布
-2 平板涂布操作图
使用无菌吸头吸取10-4、10-5和10- mL加入到已凝好的平板中,-2所示,在培养基表面涂布均匀,室温下静置20 min,使菌液吸附进培养基。
平板涂布方法: mL菌悬液小心滴在平板培养基表面中央区域,右手拿无菌玻璃涂布棒平放在平板培养基表面上,将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动,使之分布均匀,然后