流式细胞分选服务预约注意事项.doc

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——流式细胞分选服务预约注意事项
一、服务项目
无菌细胞分选: 各种细胞系、原代细胞、肿瘤组织单细胞悬液等;
特殊细胞分选或其他项目:请联系管理员黄莹莹(risa929@; 0571-88981951);
本仪器以分选为主,不承接流式分析实验,建议事先使用其它流式细胞仪确认细胞阳性染色比例。如特殊情况确需本仪器分析的,请联系管理员。
二、特别注意
安全性问题:由于在分选过程中,样本可能通过液滴震荡产生气溶胶,所以不接受会传播人类病原菌的生物有害样本,也不接受含放射性生物样品。
应知道细胞的大小与形态,以便选择分选用喷嘴。所分选细胞的直径最好小于喷嘴直径的1/5,至少小于1/3。细胞的形态也会影响了分选的结果,理论上越接近于球形的细胞,分选过程中的剪切力对细胞造成的伤害就越小。形态特殊的细胞应选择较大的喷嘴,以减轻分选过程对细胞造成的伤害。
各种细胞的建议浓度和所用喷嘴如下表。
Table 1 细胞种类和浓度、喷嘴的选择
细胞种类
浓度
喷嘴
Lymphocytes, thymocytes or splenocytes (直径8-12 μm)
8 - 12 × 106 /ml
70μm
Activated lymphocytes, smaller cell lines (直径12-20 μm)
7- 9 × 106 /ml
85 μm
Large adherent cell line (直径>20 μm)
5 - 8 × 106 /ml
100μm
荧光染料的选择:如选择1到4个荧光标记,一般按如下顺序选择,FITC、PE、APC和PerCP。
三、样本制备
样本制备基本流程:
获取细胞悬液→荧光抗体染色→调整细胞浓度(参考Table 1)→过滤细胞→移入流式管→避光置冰上运至分选室→上机检测并设定分选条件→分选细胞→上机回测,检测纯度。
注:分选前的细胞一定要过滤过(一般用300目滤网),否则会堵机器的。
分选所用的细胞染色方法与分析所用方法基本相同,但需要注意以下几点:
保证样本的无菌状态,因为分选得到的细胞还要继续培养;
不能使用固定剂固定细胞,因为活细胞经固定剂处理后即死亡;
保证上机样品为单细胞悬液;
准备充足的细胞,详见Table 1;
建议分选上样管中的缓冲液使用含2% FBS的PBS,普通培养基中的酚红可能会干扰分选;若用培养基的话,颜色不能太深,血清浓度不能超过2%,否则粘性太大影响分选。
如细胞分选后需再次培养,请准备含血清的收集管,在分选前交操作员。建议在5ml离心管中加入1-2ml血清及其它必需组分,保证分选完毕时血清浓度大于5%;
如要分选GFP等转染的样品,请提供未经转染的相同细胞为阴性对照;
如要做多重荧光染色标本的分选,请提供各种单一荧光染色的标本;
如要去除死细胞,在不影响后续实验前提下,可以加入7-AAD或是PI;
快速简便的样本处理有利于分选:处理好的样本尽快上机,分选好的细胞尽快下一步实验,如果要分选多个样本,建议一次处理一个,估计可能的上机时间后,再处理第二个样本。

Q1. 上机样品需要溶在何种溶液中?是否可以就直接放在原本培养的培养基中?
Ans: 建议不要放培养基中,因为Phenol