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第二章基因工程的工具酶
基因工程的工具酶(instrumental enzyme of gene engineering)是应用于基因工程各种酶的总称,包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因制取、重组体DNA制备等所需要的酶类。
1、限制性内切酶
2、***化酶
3、DNA连接酶
4、DNA聚合酶
5、RNA聚合酶
6、磷酸激酶和磷酸酶
7、核酸酶
8、核酶
基因工程工具酶
一、限制性核酸内切酶(restriction enzyme)
限制性内切酶的发现
限制性内切酶的分类
限制性内切酶的命名
限制性内切酶的活性单位
限制性内切酶的切割特点
限制性内切酶的反应条件
限制性内切酶的应用
细菌的限制—修饰作用
1952年,Luria和Human,
1953年,Bertani和Weigle
发现细菌的限制(restriction)现象:
Phageλ(k)
k
E .coli B[E .coli B 限制λ(k)]
感染
不感染
1、限制性核酸内切酶的发现
菌株
噬菌体感染率
k
B
C
K
1
10-4
10-4
B
10-4
1
10-4
C
1
1
1
噬菌体侵染细菌
l
B含有EcoB核酸酶和EcoB***化酶
当λ(k) B时,由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列,被降解掉。
B的DNA中虽然也存在这种特异序列,但可在EcoB***化酶的作用下,催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)将***转移给限制酶识别序列的特定碱基,使之***化。
Eco B核酸酶不能识别已***化的序列。
仍有少量phage λ(K)可在 E. coli B中生存, B phage 对λ(K)进行了修饰。
大肠杆菌B
大肠杆菌K
修饰的phage λ(B)
修饰的phage λ(K)
10-4(限制作用)
10-4(限制作用)
1(修饰作用)
R-M系统
细菌中存在位点特异性限制酶和特异性***化酶,构成了寄主控制的限制—修饰系统(R-M Restriction-modification system)。
R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统的限制酶可以降解DNA,为避免自身DNA的降解,细菌可以修饰(***化酶)自身DNA,未被修饰的外来DNA则会被降解。
个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰,则可免予被降解。