成人脂肪源Flk1+CD31.doc

***脂肪源Flk1+CD31
:房佰俊,宋永平,曹莹,林全德,买玲
【摘要】目的体外定向诱导***脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞向胰岛样细胞分化。方法首先将***脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞培养在含适当浓度的B27、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及表皮生长因子(EGF)的培养基中诱导,接着更换诱导培养基,用含适当浓度的β细胞调节素、尼克酰***等高糖无血清培养基诱导细胞向胰岛样细胞分化。用RTPCR法检测诱导前后nestin、ngn3、胰岛素启动子因子1(IPF1)、胰岛素及胰高血糖素基因的表达;免疫荧光染色法检测诱导前后nestin、胰岛素及胰高血糖素的表达;放射免疫分析法检测诱导前后细胞分泌胰岛素情况。结果***脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞经第一阶段的诱导后可分化成nestin 阳性的祖细胞,继续诱导6d后变圆的细胞逐渐增多,并最终聚集成团。免疫荧光实验证明经诱导后的细胞表达胰岛素、胰高血糖素、生长抑素等内分泌激素;放免分析结果表明,诱导的胰岛样细胞团可以分泌胰岛素。结论***脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞具有胰腺干祖细胞的固有特征,极有可能作为种子细胞用糖尿病的细胞治疗。
【关键词】干细胞;胰岛;脂肪
糖尿病是严重危害人类健康的常见多发病,目前临床对Ⅰ型糖尿病所用的胰岛素注射疗法并不能令人满意。近几年,经肝内门静脉植入胰岛细胞治疗糖尿病取得了一些疗效[1],但遗憾的是,胰岛细胞移植仍面临诸多难题,如供者不足及严重的免疫排斥反应等。因此,积极寻找新的胰岛细胞资源已成为当务之急。胚胎干细胞具有发育的全能性,可自发分化或经诱导分化为胰岛细胞[23]。另外,有学者[4]对胰管上皮细胞及胰岛细胞进行培养,诱导nestin阳性的胰腺干细胞分化为内分泌腺细胞。可见,胚胎干细胞和胰腺干细胞均可成为糖尿病细胞治疗的种子细胞。但是,它们又存在伦理学上的争论及取材不便等问题,从而限制了临床运用。我们前期的研究结果提示,***脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞几乎具有类似于胚胎干细胞的全能性[5]。因此,在本实验中,我们探索了诱导***脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞向胰岛样细胞分化的条件,以为用细胞治疗糖尿病提供合适的种子细胞。
1 材料与方法
***脂肪源Flk1+CD31-CD34-细胞的分离和培养[5]
抽取适量皮下脂肪组织,剪碎,用DHanks液洗去血细胞,20mg/L Ⅱ型胶原酶消化2h,洗掉胶原酶,用FicollPaque()分离液分离得到单个核细胞后,用CD45及GlyA磁珠(德国Miltenyi Biotec公司)分选去除CD45+及GlyA+细胞,将阴性选择所得细胞接种在96孔细胞培养板中(每孔1个细胞)。96孔板预先以ECM胶[含5g/L骨形态发生蛋白4(bone morphogeic protein
4, BMP4,美国Sigma公司), 30μg/L干细胞因子(stem cell factor,SCF,美国Sigma公司)及3%(体积分数)胎牛血清(英国Gibco公司)]铺板。20d后,挑取单克隆细胞,扩增备用。扩增培养液成分为:40%(体积分数) MCDB(英国Gibco公司),56%(体积分数)DF12(英国Gibco公司),4