紫外吸收法测定核酸含量.ppt

实验十二紫外吸收法测定核酸含量
实验目的
(1)掌握紫外吸收法测定核酸含量的原理。
(2)掌握利用紫外分光光度计测定核酸含量的方法
原理
DNA和RNA都有吸收紫外线的性质,最大吸收峰在260nm波长处。紫外吸收使嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的性质,所有含嘌呤和嘧啶的物质,都具有吸收紫外线的特性。核酸和核苷酸的摩尔吸收系数用ε(P)表示。ε(P)为每升溶液中含有1mol核酸磷时的光密度(即吸光度或光吸收)。RNA的ε(P)为7700~7800,%, ~。小牛胸腺DNA钠盐的ε(P)(260nm,pH7)为6600,%, 。
不同形式DNA紫外光密度不同,因为DNA具有双螺旋结构,当过量的酸、碱或加热使DNA变性时,则出现ε(P)260nm值升高的增色效应。在核苷酸量相同的情况下,ε(P)260nm有以下关系:单核苷酸>单链DNA>双链DNA。DNA变性后,双螺旋结构被破坏,碱基充分暴露,导致紫外光密度增加,还可根据DNA溶液在260nm处光密度的变化监测DNA变性情况。变性DNA复性后,ε(P)260nm值降低,称为减色效应。
蛋白质由于含有芳香氨基酸,也能吸收紫外光。蛋白质的吸收峰在280nm,260nm处的光密度仅为核酸的1/10或更低,因此核酸样品只能够蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。,。当样品中蛋白质含量较高时该比值会下降。紫外吸收法测定核酸含量简便快速,灵敏度高,一般可达3μg/ml的检测水平。
操作方法
一、将样品配制成每毫升含550g的核酸溶液,与紫外分光光度计上测定260nm处的光密度值,按下式计算核酸浓度和两者的吸收比值。
式中 OD260nm—260nm波长处的光密度值;
L—比色杯的厚度,;
—每毫升溶液内含