4第四章节 目的基因的制备2.ppt

第四章目的基因的制备
第二节目的基因的制备
三、cDNA基因文库的构建及目的基因的分离
(1)c DNA文库的概念
直接从生物体分离目的基因很困难,但在某一特定发育期和特定组织仅得以表达的基因仅占总基因数的15%,产生mRNA,因此从mRNA出发分离目的基因,大大降低难度。
某生物基因组转录的全部或部分mRNA经反转录产生的各种cDN***段,分别与载体重组而存在于一种受体的群体,即cDNA基因(部分)文库。
表达型:必须采用表达载体(如λgt11) 。插入片段可表达融合蛋白,有活性、抗原性。常采用能与表达产物发生特异性结合的抗体或化合物进行标记筛选。特别适用于氨基酸序列不清楚的蛋白质的筛选。
非表达型:可用一般载体(如λgt10) ,适用于已知氨基酸顺序或其同源序列蛋白质,根据氨基酸密码子,人工合成寡核苷酸作为探针进行筛选。
cDNA文库可分为
cDNA文库按所用载体分:
质粒cDNA文库(含克隆数少,适于高丰度mRNA)
噬菌体cDNA文库(含克隆数多,适于低或极低丰度mRNA)
分离细胞总RNA,并从中分离纯化出mRNA
(含oligo(dT)的纤维素柱)
以mRNA 为模板,合成cDNA 第一链
双链cDNA 的合成
常用方法:第一第二第三第四第五
将合成的双链DNA重组入载体,导入宿主(大肠杆菌)增殖
(2)cDNA文库的构建
要获得高丰度的某mRNA, 必须选好适当的材料.
c DNA基因文库大小理论公式
cDNA的克隆数
=细胞总mRNA数/细胞中某种mRNA的拷贝数
实际需构建的最小值远超过公式理论值
经验公式: N=ln( 1-P ) / ln( 1-f )
N: c DNA基因文库必需的克隆数
P:文库中含目的基因c DN***段的出现概率
f:某mRNA 的丰度/ 总mRNA数的比值
(3)mRNA的丰度与cDNA基因文库大小的关系
根据经验公式,提高目的基因mRNA在总mRNA数的比例(f)可减少cDNA文库的克隆子数,构建前用各种方法富集和提高目的mRNA丰度,可降低文库的复杂性和分离难度.
N=ln( 1-P ) / ln( 1-f )
与基因组文库相比,在构建和基因分离方法上有以下优越性:
某些RNA病毒分离的唯一方法;
筛选简单易行;
假阳性概率降低;
直接用于基因工程操作;
研究真核细胞mRNA的结构和功能.
(4)cDNA克隆的优越性
四、利用聚合酶链式反应技术扩增目的基因
(1)套式PCR
(2)反向PCR
(3)不对称PCR
(4)锚定PCR
(5)长程PCR
(6)反转录PCR
(7)锅柄PCR
(8)Alu PCR
若已知目的基因的全序列或其两侧序列,可通过合成一对与模板DNA互补的引物,十分有效地扩增出所需的DN***段。
要求待扩增的DN***段的序列已知或至少其两端20bp左右序列已知。
利用常规PCR只能合成1kb以内长度的DN***段
特殊类型PCR可满足多种需要。