脂肪酶的分离纯化.doc

贺州学院课程考核试卷(论文)
(2013—2014学年第 1 学期)
课程名称:酶工程开课单位:化生学院
考核年级、专业:11生物工程任课教师:何彩梅
论文题目:脂肪酶的分离纯化
脂肪酶的分离纯化
摘要:采用简单的两步法—离子交换层析和疏水层析法,对Candida sp. 99−125 脂肪酶进行了纯化,,达到27200 U/mg,%. SDS−PAGE 电泳分析显示该酶的分子量约为38 kDa. 酶学性质研究表明,该
酶最适反应温度为40℃,最适反应pH ,在室温下具有良好的稳定性. 钙离子和Tween80 能够促进提高脂肪酶的活性,而铁离子、铜离子和SDS 对其有明显的抑制作用.
前言
脂肪酶(Lipase, )是一类重要的酯键水解酶. 与动植物脂肪酶相比,微生物脂肪酶的制备周期短,作用pH 和作用温度范围广,底物专一性强,便于进行工业生产和制备高纯度制剂[1].
在众多脂肪酶中,假丝酵母系(Candida sp.)脂肪酶的用途最为广泛,特别是用于合成短碳链酯类化合物如香料、生物柴油等物质[2]和手性化合物的拆分反应[3].Candida sp. 99-125 是本实验室保存的一类菌种,目前已应用于生物柴油[4]、维生素A 酯[5]、棕榈酸异辛酯[6]等物质的催化合成研究. 然而该菌株生产的脂肪酶中含有大量的杂质,不仅影响脂肪酶的酶活水平,而且对酶促催化反应带来许多不利因素. 为此,本研究采用简单的两步法—离子交换层析和疏水层析法分离纯化Candidasp. 99-125 脂肪酶,并对纯化后酶的性质进行了研究.
2 材料与方法
试剂与仪器
粗酶粉,产酶菌株为Candida sp. 99−125,实验室自制;聚丙烯酰***;液相色谱仪;SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)电泳仪;DEAE Sepharose FF 层析柱和PhenylSepharose FF (Low sub)层析柱.
实验方法
粗酶液的制备
取2 g 粗酶粉溶于20 mL Tris-HCl (20 mmol/L, pH=)缓冲液,待搅拌均匀离心,取上清液为上柱用的粗酶液. 粗酶液中蛋白的比活为2710 U/mg.
离子交换层析法纯化脂肪酶
以20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液(pH=)平衡离子交换层析柱,上样4 mL 粗酶液. 先以Tris-HCl 缓冲液冲洗掉未被离子交换层析柱结合的蛋白,再用0~ mol/L
的NaCl 溶液进行浓度梯度洗脱,洗脱体积为15 倍柱体积,最后以1 mol/L NaCl 溶液彻底洗脱结合蛋白. 分步收集洗脱液进行分析,合并酶活高的组分.
疏水层析法纯化脂肪酶
mol/L, mol/L 硫酸铵(AS)缓冲液(pH=)平衡的疏水层析柱中.
mol/L 硫酸铵缓冲液冲洗掉未被结合的蛋白,~ mol/L 的硫酸铵缓冲液进行浓度梯度洗脱,洗脱体积为10 倍柱体积,最后以20 mmol/L Tris-HCl (pH=)缓冲液继续冲洗至彻底洗脱