武汉大学病理教研室免疫组织化学的应用IHC通过检测细胞内.ppt

免疫组织化学实验技术
杨飞
武汉大学基础医学院
病理与病理生理学系
武汉大学病理教研室
免疫组织化学技术的定义
免疫组织化学技术(Immunohistochemistry, IHC)是用标记的特异性抗体(或抗原)对组织内的抗原(或抗体)的分布进行定位、定性、定量检测,经过组织化学呈色反应在组织原位显示抗原(或抗体),如各种蛋白质、多肽、磷脂和多糖等成分的一门新技术。
武汉大学病理教研室
免疫组织化学的应用
IHC通过检测细胞内、细胞表面或细胞间的正常或异常的物质,以研究组织细胞的正常生理、代谢及疾病的病因、发病机理,广泛用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测,细胞属性的判定、淋巴细胞的免疫表型分析、细胞增殖和凋亡的研究,以及细胞周期和信号转导的研究等。
武汉大学病理教研室
实验内容
链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法
(Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 简称S-P法)
检测胃癌组织CK/Vimentin的蛋白表达
武汉大学病理教研室
S-P法原理示意图
过氧化物酶
链酶亲和素
生物素
生物素化二抗
特异性一抗
待测抗原
武汉大学病理教研室
免疫组织化学基本实验流程
组织、细胞标本
抗原修复
阻断内源性过氧化物酶
正常血清封闭
滴加特异性一抗
滴加二抗
滴加三抗
显色
复染
封片
武汉大学病理教研室
实验步骤
,梯度酒精水化, PBS(pH )漂洗3×5min;
;
, PBS(pH )漂洗3×5min;
(试剂A),37℃湿盒孵育 10min;
PBS(pH )漂洗3×5min;
(试剂B),37℃湿盒孵育 10min;
武汉大学病理教研室
,分别滴加2种抗体,4℃湿盒孵育过夜, PBS(pH )漂洗3×5min;
(试剂C),37℃湿盒孵育 15min, PBS(pH )漂洗3×5min;
-过氧化物酶溶液(试剂D),37℃湿盒孵育 15min,甩去多余液体;
***联苯***(DAB)显色液,光镜下控制反应时间(约为1-5min),自来水充分冲洗,苏木素复染;
、透明、中性树胶封片并镜检分析;
,阴性对照采用PBS取代第一抗体,其余步骤相同。
武汉大学病理教研室
实验流程中的注意事项
内源性过氧化物酶的灭活
血清封闭
冲洗
抗体选择及一抗孵育时间
检测及显色系统
复染
武汉大学病理教研室
染色前处理 -取材、脱水、浸蜡
组织及时固定
固定剂选择:10%中性缓冲福尔马林
4%多聚甲醛
常规下固定8~24小时
取材厚度:2 mm
武汉大学病理教研室