real time pcr.pptx

中心法则
遗传信息从DNA传递给RNA,再从RNA传递给蛋白质
基本背景
DNA 存在于细胞核中并编码了基因
转录:双链DNA解链后利用其中一条链(编码链)合成信使RNA(mRNA)
翻译:mRNA从细胞核转移到细胞质中,mRNA 结合上核糖体开始翻译成蛋白质
蛋白执行基因的功能
Real-time PCR 步骤
1)RNA抽提—DEPC(RNA酶抑制剂)
2)RNA质量检测:  OD260/OD280=
3)RT-PCR合成cDNA
4)Real-time PCR
一、Biomiga 总RNA提取系列产品
BIOMIGA RNA提取系列具有以下特点;
1,产品使用方便,操作简单,节省时间。
2,得到的总RNA纯度高,完整性好,无蛋白及核酸酶的污染,可以直接用于RT-PCR,Northern 杂交,Real-time PCR等下游实验。
3,产品使用范围广,针对不同的样品BIOMIGA开发了多种试剂盒。
BIOMIGA RNA 纯化系列产品
Biozol RNA 提取试剂
RNA小量提取吸附柱
独立包装
Biozol RNA 提取试剂盒
RNA提取系列
Biozol 提取试剂盒(R7311)--基于异硫***酸胍/酚/***仿为基础的柱式提取方法。该试剂盒适应范围更广,可从血液、植物、动物、酵母、细菌中提取总RNA。
组织、真核RNA提取试剂盒(R6311)--适用于从各种组织或培养细胞中分离纯化总RNA,包括一些难于纯化总RNA的纤维组织,如骨骼肌,心脏和动脉组织等。
血液RNA提取试剂盒(R6411)--新鲜血液
植物RNA提取试剂盒(R6611)--新鲜或冷藏的植物组织
细菌RNA提取试剂盒(R6616)--革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌
病毒RNA提取试剂盒--(R6620)--适用于从血浆,血清,尿液,分泌液及其它无细胞体液中分离纯化病毒RNA
二、RNA 质量控制
One Drop!
检测所需样品量少,1-2uL
RNA: OD260/OD280=
三、RT-PCR
RT-PCR是将RNA模板的反转录(RT),和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。
RNA抽提---RNA反转录为cDNA --- cDNA进行PCR扩增
RT-PCR原理
利用逆转录酶能将RNA逆转录成DNA的特性,通过合适的引物,将细胞内的RNA(一般为mRNA)逆转录成cDNA,
然后,通过PCR技术,将痕量的cDNA扩增成大量的双链DNA。
逆转录步骤
cDNA 链合成, 互补 mRNA链,一般利用polyT作为引物,也可用特异性的序列作为引物
G U A A U C C U CAAAAAAAAAAAAAAA
Reverse transcriptase
mRNA
cDNA
T T A G G A G
TTTTTTTTTTTTTTT
逆转录polyT引物
AMV:AMV反转录酶具有反转录效率高、耐热度高的优点,但其RNase H活性很高,导致cDNA合成片断短的缺点。
MMLV:反转录效率较低、耐热度低,其RNase H活性也较低,适合应用于长片断cDNA的合成。