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军医进修学院博士学位论文
P21 0b”^”激活鞘氨醇激酶信号通路的初步研究
中文摘要
慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)是一种以髓系细胞受累为主的多能造血干细胞的克隆性疾病。目前认为CML的主要分子发病基础为: 位于9q34的abl基因与位于22q11的bcr基因相互易位形成bcr/abl融合基因,并
编码具有很强蛋白酪氨酸激酶活性的P210k“M融合蛋白,该蛋白通过多种信号通
路抑制细胞凋亡而导致细胞转化。细胞膜鞘磷脂代谢的两种重要产物,即神经酰***和1一磷酸鞘氨醇(SIP)的动态水平也是决定细胞凋亡和增殖的重要因素。神经酰***促进细胞凋亡,抑制细胞增殖;而l一磷酸鞘氨醇则抑制细胞凋亡、刺激细胞生长增殖。鞘氨醇激酶一1(sphingosine kinase,SphK—1)作为SIP生物合成调节的关键限速酶,与细胞抗凋亡、增殖效应密切相关。本研究重点探讨了P210鼢㈨。的抗凋亡效应是否与SphK一1/S1P信号通路有关,以便为CML的发病和治疗提供新的作用靶点。
首先我们利用RT-PCR证实了bcr/abl阳性的CML细胞表达SphK一1信号通路的相关分子。。格列卫可以竞争性地结合到P2106。舳1的三磷酸腺苷酸结合位点而特异性地抑制其酪氨酸激酶活性,为探讨CML细胞中P210k舳1和SphK一1信号通路的
关系,我们利用格列卫处理bcr/abl阳性的K562细胞和CML原代细胞,然后通过 。K562细胞在使用格列卫处理后 SphK一1活性较对照下降(~,CML原代细胞在使用格列卫处理后SphK-1 活性较对照下降(~)%,间接提示P210雠““可能具有激活SphK一1的作用。为进一步证实P210b。“曲1对SphK一1的激活作用,我们构建了携带b3a2型bcr/abl
融合基因的逆转录病毒载体。将重组质粒转染包装细胞制备重组逆转录病毒感染 M07e细胞,然后裂解,收集转染bcr/,-l 活性比M07e—pLXSN细胞高(23~32)%,。为进一步确定P210k““,我们进一步使用Tet—off诱导表达系统观察了P2106。“。将bcr/abl融合基因亚克隆到
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pTRE2hyg载体,并筛选构建能有效诱导目的基因表达的293Tet—off细胞,将bcr/abl 基因与pTRE2hyg载体连接的重组质粒pT2一P210转染到293Tet—off细胞中,筛选出bcr/,293一P210单克隆细胞在bcr/
()%,进一步直接说明bcr/abl基因的表达能显著增加SphK一1活性。 Raf-{言号通路是P210kr/abl在慢性粒细胞白血病致病
机理中的重要通路,我们使用P210bc咖b1的抑制剂格列卫处理CML细胞后发现 ERKl/2磷酸化被部分抑制,证实P210乩“M能够激活Raf-MEK—ERKl/2信号通路。进一步使用PD98059和Wortmannin处理细胞分别阻断Raf-MEK.