sdspage凝胶电泳-1.pptx

SDS-PAGE凝胶电泳
实验原理
实验步骤
注意事项
SDS-PAGE的优点
SDS-PAGE的缺点
实验常见问题及处理
小技巧
实验原理
源起
基本原理
分类
分离范围
实验中各成分作用
源起
1967年由Shapiro建立。
1969年由Weber和Osborn进一步完善。
他们发现样品介质和丙烯酰***凝胶中加入离子去污剂(SDS)以后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽视.
基本原理之一
阴离子去污剂SDS破坏蛋白质分子之间及与其它物质分子之间的非共价键,使蛋白质变性而改变其原有的构象,并同蛋白质分子充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。
强还原剂巯基乙醇打开蛋白质分子内的二硫键使这种结合更加充分。
基本原理之二
结合了SDS的蛋白质在水溶液中的形状类似于长椭圆棒,不同的蛋白质-SDS复合物其椭圆棒的短轴长度恒定,而长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比。
这样的蛋白质-SDS复合物在电场作用下,其迁移率便不再受蛋白质原有的净电荷及形状等因素的影响,而主要取决于其分子量大小这一因素。根据这一特点,就可以将各蛋白组分按分子量大小分开。
分类
PAGE根据其有无浓缩效应,分为连续系统和不连续系统两大类.
连续系统电泳体系中,缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。
电泳槽
不连续系统
不连续系统中由于缓冲液离子成分,pH,凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
浓缩胶
浓缩胶的作用是有堆积作用,凝胶浓度较小,孔径较大,把较稀的样品加在浓缩胶上,经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
当样品液和浓缩胶选Tris/HCl缓冲液,电级液选Tris/甘氨酸。电泳开始后,HCl解离成***离子,甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷,因此一起向正极移动,其中***离子最快,甘氨酸根离子最慢,蛋白居中。