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siRNA 干扰大肠癌细胞株 galectin-3 蛋白表达的研究
研究生:黄青
导 师:黄健清 副主任医师
中文摘要
研究背景:
Small interfering RNA (siRNA)是一种长度为 21-25 核苷酸的小 RNA 分子, 由 Dicer(RNAase Ⅲ家族中对双链 RNA 具有特异性的酶)加工而成,其是 siRISC 的主要成员,可激发与之互补的目标 mRNA 的沉默。本课题前期的研究显示:免疫组织化学方法检测到半乳糖凝集素-3(galectin-3)蛋白在 II 期大肠癌的实体瘤标本中呈现一种高表达的趋势,与癌旁组织相比,具有显著性差异;且在随后的大肠癌细胞实验中发现,低分子柑橘果胶(Low molecular weight citrus pectin,LCP)+奥沙利铂联合组较奥沙利铂单药组可增加大肠癌细胞 HCT-116、 HT29 的细胞凋亡,联合组和单药组差异具有显著意义;此外,在小鼠结肠癌肝转移模型的研究中还发现:ELISA 方法检测显示 Galectin-3 在结肠癌肝转移中呈高水平表达,与阴性对照组相比,差异具有显著意义(P<),且 LCP 能明显抑制结肠癌肝转移的发生。本次实验旨在通过对大肠癌细胞株中的 galectin-3 蛋白进行干扰来进一步地证实 galectin-3 蛋白在大肠癌治疗中的作用同时也为大肠癌的靶向治疗提供一定的积极的理论基础。
方法:
HCT116、HT29、SW116、SW480 和 SW620 的培养:
用含 10%胎牛血清的 RPMI1640 细胞培养液,在 37 摄氏度、5%CO2 的培养箱中分别培养五种大肠癌细胞株 HCT116、HT29、SW116、SW480 和 SW620,每 2-3 天换液一次,待该贴壁细胞生长至 80%密度时进行传代,传代 2-3 次后选择状态较好的对数生长期细胞进行试验;
将上述对数期生长状态较好的大肠癌细胞株进行离心收集,然后向其中加入细胞冻存液 40%RPMI1640、50%胎牛血清以及 10%二***亚砜(DMSO)总体积为 毫升,反复轻轻吹打培养液数次,重悬细胞,冻存保种的细胞浓度最好控
制在 5X106 个/毫升左右的水平以确保最佳的冻存效果,再分别进行 4 摄氏度以及液氮罐保种备用。
bloting 法筛选出 galectin-3 蛋白含量最高的细胞株: 选择上述对数期生长状态较好的五种大肠癌细胞株:HCT116、HT29、SW116、
SW480 和 SW620 细胞,采用 WB 方法依次进行蛋白样品的收集、 封闭 galectin-3 的表达:
针对 galectin-3 基因进行 shRNA 靶点序列的设计并进行合成;
将 siRNA 序列克隆至慢病毒干扰载体中并确保测序的正确;
将已制备好并测序正确的 galectin-3 慢病毒干扰载体以及其他的包装用质粒共同转染到慢病毒包装细胞系中,制备慢病毒;
将上述制备好的慢病毒进行感染靶细胞,感染一段时间后再用 WB 方法对 galectin-3 蛋白表达抑制效果的鉴定。
western bloting 方法检测 siRNA 封闭 galectin-3 蛋白表达的效果: 收集上述经过感染处理后的靶细胞,然后用 WB 方法对其进行干扰效果的
测定,并同时用抗生素筛选出抑制效果较好的稳定细胞株,收集该稳定细胞株并进行 4 摄氏度以及液氮罐保种以备后续实验所需。
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细胞培养:
分别向 A 组(未经 siRNA 封闭 galectin-3 表达的细胞株)和 B 组(经 siRNA 封闭 galectin-3 表达的细胞株)加入 IC50 终浓度的奥沙利铂进行处理并在培养瓶上做好标记以便于识别;
:K-8 法测定的结果显示大肠癌细胞株的奥沙利铂 IC50 值结果如下所示:
大肠癌细胞株 IC50 值
HCT116 细胞 微摩尔/升
HT29 细胞 微摩尔/升
SW116 细胞 摩尔/升
SW480 细胞 摩尔/升从上述数据可见,奥沙利铂的培养液终浓度应该选择 galectin-3 蛋白表达
量最高的 SW116 的奥沙利铂 IC50 值 摩尔/升;
分别孵育 A、B 两组细胞至 6 小时、24 小时、以及 48h 用 AnnexinV-FITC/PI
双染细胞凋亡检测试剂盒(货号为 KGA106)对其进行细胞凋亡的检测:PBS 洗 2 次;重悬细胞