sirna干扰胃癌bgc823细胞中polβ表达的初步研究.docx

郑州人学2007届硕士研究生毕业论文 中文摘要
(posttranscriptional gene silencing,PTGS)现象。该技术能够有效使转录后基因沉默,甚至可以代替基因敲除,是目前研究基因调控的重要手段。
本研究构建pol B基因靶向的siRNA表达载体,转染到胃癌细胞株BGC一823 中,检测该细胞中pol B基因表达的沉默效果,同时初步观察pol B基因表达抑制后对细胞生物学行为的影响。
实验方法
利用Takara、Ambion和Promega siRNA靶序列分析设计系统,扫描人pol B cDNA编码序列(M13140),依据siRNA靶序列设计原则,经BLAST同源性分析, 选择确定19个碱基的siRNA靶序列。分别合成2对靶向pol 8 siRNA序列和一对无关siRNA的DNA单链,退火成双链DNA,用BamHl和XhoI双酶切siRNA表达载体pRNAT—;将具有相同酶切位点的发卡样siRN***段克隆入siRNA表达载体pRNAT—;利用PCR扩增法筛选鉴定重组子pRNAT— B l、
pRNAT— B 2、pRNAT—;对插入序列进行DNA序列分析。将siRNA 表达载体pRNAT— B 1、pRNAT— B 2、pRNAT—-Con转入人胃癌细胞系BGC一823中,同时设空载体对照组(转染空载体pRNAT—)和空白对照组(未转染);.用荧光定量PCR方法检测各组细胞pol p mRNA表达水平; 用流式细胞术检测各组细胞周期及细胞增殖率,并将各组的细胞注射裸鼠皮下组织以观察肿瘤细胞体内的增殖情况,最后用荧光定量PCR检测各组肿瘤组织中 pol BmRNA表达水平。
实验结果
,对这些候选序列通过同源序列检索和进一步优
选,最终确定5’274—292位(AAGCTATC)和661—679位
(GATTCGGCAGGATGATACG)为siRNA靶序列,并选择一无关对照的发卡样DNA 序列。
B 1、sipol B 2和Con,电泳可见三条明亮条带,位于约70bp处,与设计完全一致。
— B 1、pRNAT— B 2和 pRNAT—-Con,测序分析其序列与设计完全一致。
,经G418筛
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选转染细胞得到对其有抗性的细胞。
6靶向siRNA(pRNAT— B 1。pRNAT— 8 2)的 BGC一823细胞,DNA聚合酶6基因的mRNA表达水平明显降低,pRNAT— B 2的沉默抑制作用强于pRNAT— 8 1,几近完全抑制。转染无关 siRNA(pRNAT—)BC-C一823细胞,pol B mRNA表达水平不降低。
,结果显示呈现部分抑制作用的实验组1裸鼠肿瘤的生长速度、大小及重量均低于对照组及实验组2(P< ),而呈现几乎完全抑制作用的实验组2裸鼠肿瘤的生长速度、大小及重量均高于其它组(P<)。其各组肿瘤组织中pol B mRNA表达水平结果与各组细胞中的结果一致。
结论
B的高表达和近乎完全抑制的超低水平表达都不利于维持细胞的生理状态;BGC-823细胞中pol B表达,通过siRNA沉默到合适的低水平,对肿瘤的生长可以起到抑制作用。
关键词:DNA聚合酶B;siRNA:RNA干扰;胃癌;荧光定量PCR;流式细胞术
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The Initial Study on Expression of DNA pol 13 mRNA in
BGC-823 Cell Silenced by siRNA
Postgraduate Wang Lei
Tutor Zhao Guoqiang Dong Ziming Department of Pathyphysiology,School of Ba甜c Medical Science
Zhengzhou University Zhengzhou,450001
Abstract
Background and objectives
DNA polymerase beta(DNA pol B)is a hous