薄层色谱扫描法.doc

薄层色谱扫描法标准操作规程
1 简述
薄层色谱扫描法是指用一束一定波长、一定强度的紫外或可见光对薄层板进行扫描,测定薄层板上的样品斑点对光的吸收强度或斑点经激发后所产生的荧光强度。所得到的图谱及积分数据用于药品的鉴别、检查和含量测定的方法。
薄层色谱扫描法可分为吸收法和荧光法。扫描时测定薄层板上的方法称为荧光法。吸收法测定可采用反射法或透射法两种方式进行扫描。反射法是指测定样品斑点对照射光的反射情况进行测定的方法;透射法则是测定照射光穿透样品斑点后光的吸收情况。荧光法测定均采用反射法。透射法大多用于凝胶色谱的扫描,非透明介质薄层板的扫描主要为反射式吸收法或荧光扫描法。
薄层色谱扫描可使用单波长和双波长进行测定。单波长薄层扫描适合于分离度好,背景干扰小的薄层色谱。双波长薄层扫描时用测定波长和参比波长分别扫描层板,测定样品斑点在两波长下的吸收度之差,可减少分离度欠佳的组分间的相互干扰,并减少薄层板的背景干扰,操作时应选择待测斑点无吸收或最小吸收的波长作为参比波长。
根据扫描时光束的轨迹不同,波长色谱扫描又可分为线性扫描和锯齿扫描。线性扫描时一般采用一束比待测斑点略宽的狭窄光带沿展开方向作单向等速扫描,它适合于形状较规则斑点的扫描。锯齿扫描是用使用微小正方形光束沿展开方向扫描的同时,在垂直于展开方向进行反复式扫描,扫描过程中光束的运动轨迹呈锯齿形或矩形,它对于形状不规则或分布不均匀的斑点扫描重复性较好,但扫描速度较慢。
在采用反射式吸收法测定时,入射光照射到薄层板上,一部分照射过薄层板,一部分光发生反射,此外还产生大量的散射光。因此,波长扫描定量一般不符合Lambert-Beer定律,其样品量与反射光强度符合Kubelka-Munk方程:
(1-R)2/R=
其中R为反射光强,ε为样品吸收系数,C为样品浓度,S为薄层板散射系数。
由此方程可知,样品吸收系数和薄层板散射系数均可影响波长扫描反射法定量的工作曲线方程。
2 仪器
仪器组成
波长扫描仪主要由光源、单色器、薄层板台、检测器以及工作站组成。
光源在可见光区域主要使用钨灯(370-700nm),紫外区多使用氘灯(200-370nm)。此外还有***灯、氙灯等。其中***灯为线光源,可发射特征辐射光谱。
单色器用来提供一定波长的单色光。其结构与一般的紫外分光光度计类似,通常由入射狭缝、出射狭缝、平行光装置、色散元件等组成。波长扫描多采用光栅为其色散元件。
薄层板台扫描时薄层板***灯与薄层板台上,薄层板台可横向及纵向移动,以完成对整块薄层板的扫描。
检测器多采用光电倍增管。此外还有检测入射光能量的参比光电倍增管,以减少入射光强度变化对扫描结果的影响。
工作站可设定仪器参数,接收并存储扫描结果,进行积分和其他计算。
仪器性能检定
波长准确度的检查可利用***灯的特征谱线对仪器的波长准确度进行检查。选取***灯,在200-700nm波长范围内以荧光方式对空白硅胶G薄层板扫描吸收图谱,图谱中的峰位波长与***灯的谱线中相应波长的差即为仪器波长准确度。***,,,,,,,。在CAMAG等仪器的工作