生化分离技术..ppt

生化分离工程
第二章生化分离技术
破碎缓冲液
-,pH为7-8的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液(与细胞内环境相似)
抗氧化剂:含二硫键的蛋白质,细胞内:高度还原;外界氧化环境。,2-巯基乙醇 2-BME,半胱氨酸Cys、谷胱甘肽GSH (还原型)
酶抑制剂:针对性添加,丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、巯基蛋白酶抑制剂碘乙酸、金属蛋白酶EDTA,etc
PVP:植物组织的破碎过程化中常用聚乙烯吡咯烷***PVP吸收酚类物质(酚类物质会与蛋白质结合形成沉淀)
细胞破碎(Cell disruption)
细胞的结构
动物/植物和微生物:前者没有细胞壁,只有脂质和蛋白质构成的柔软的细胞膜,易于破碎
细菌:革兰氏阳性菌的细胞壁比阴性菌的细胞壁坚固Why?较难破碎。
酵母或其他真菌:胞壁由葡聚糖、甘露聚糖等多糖和蛋白质构成,比革兰氏阳性菌的胞壁厚
G+:典型金黄色葡萄球菌,肽聚糖60-95%
G-:,肽聚糖10%
不同类型细菌的细胞壁结构成分:
细胞壁组成
G+
G-
肽聚糖
60-95%
10%
磷壁酸
有
0
类脂质
一般无
约20%
蛋白质
0
较高
酵母菌:由甘露聚糖、蛋白质和葡聚糖组成的“三明治”结构,其中葡聚糖主要维持细胞壁强度
细胞破碎技术
细胞破碎的目的:使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏(增大通透性)或破碎,释放其中的目标产物
机械法
非机械法
珠磨法、压榨法
高压匀浆、超声破碎、撞击法
固体剪切作用
液体剪切作用
1)酶溶法
2)化学法
3)物理法
干燥处理
溶胞作用
超临界细胞破碎
1、机械方法破碎
1)珠磨法(bead milling) :细胞悬浮液与极小的研磨剂如玻璃小珠、石英砂等一起高速搅拌,细胞与研磨剂之间相互碰撞、剪切,使细胞达到某种程度破碎,释放内含物
可采用间歇式或连续操作珠磨机
增加装珠量、延长破碎时间、提高转速等手段可提高破碎率
→总能耗增加且须注意换热
适用于多数微生物细胞,(藻类和真菌菌丝)和质地坚硬(亚细胞器)的微生物细胞
2)高压匀浆法( high-pressure homogenization )
破碎原理:利用高压使悬浮液通过针形阀,从阀座与阀之间的环隙高速喷出后撞击到碰撞环上,细胞在受到高速撞击后,急剧释放到低压环境
破碎作用力:突然减压和高速冲撞
阀座
阀
撞击环
操作参数少且易于确定,实验室及工业生产中均可
适用于酵母和多数细胞的破碎
对易造成堵塞的团状或丝状真菌及一些易损伤匀浆阀、质地坚硬的亚细胞器一般不适用
3)超声波破碎(ultrasonication)
机理:高于20kHz的超声作用下产生的空穴化作用,空穴由于超声波的冲击而产生和闭合,产生极大的冲击波和剪切力。
缺点:
A、影响因素多,细胞种类、浓度和处理时间、探头材料和形状;
B、有效能量的利用率低;
C、产热大,需控温;
D、不易放大,仅应用于实验室规模的细胞破碎。
机械破碎法总结
以上几种机械破碎法的作用机理不尽相同,有各自的适用范围(包括菌体细胞、细胞发酵液的特性)和处理规模(实验室或工业用)
方法
珠磨
高压匀浆
超声破碎
使用规模
实验室、工业用
实验室、工业用
实验室
适用对象
酵母、藻类及丝状真菌
酵母菌、细菌
细菌
2、细胞物理破碎方法
1)渗透压冲击法(osmotic shock)
最为温和的一类细胞破碎方法,适用于易于破碎的细胞,。
细胞于高渗介质中?脱水达到平衡后,迅速将其转置于低渗透压的水或缓冲液中,水进入细胞使胞壁和胞膜破裂
2)冻结-融化法(Freezing and Thawing)
细胞急剧冻结后在室温缓慢融化,反复操作多次使细胞破坏,对于存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物释放较为有效