A群脑膜炎球菌多糖菌苗制造及检定规程.docx

A群脑膜炎球菌多糖菌苗制造及检定规程
A群脑膜炎球菌多糖菌苗系用A群脑膜炎球菌液体培养后,经提纯获得的多糖抗原冻干制成。供预防A群脑膜炎球菌引起的流行性脑脊髓膜炎之用。
1 菌种
菌种来源
制造用的菌种及检定菌种用的各种诊断血清,由中国药品生物制品检定所分发或经同意。
菌种检定
形态及培养特性
将待检的菌种接种在含10%羊血普通琼脂培养基上,脑膜炎球菌在25℃不生长。35~37℃二氧化碳的环境中培养16~20小时,涂片镜检应为革兰氏阴性双球菌,亦可有单个阴性球菌。平皿分离培养显现光滑、湿润、灰白色的菌落、菌苔易取下,在生理盐水中呈均匀混悬液。
生化反应
接种葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、果糖及蔗糖,于35~37℃培养5~7日,发酵葡萄糖、麦芽糖,产酸不产气。
血清学特性
将在35~37℃培养16~20小时的菌苔,%(ml /ml)甲醛生理盐水中,或56℃加热30分钟杀菌后,使每ml含菌10亿~20亿,与同群血清做定量凝集反应,放置35~37℃过夜,次日再放置室温2小时观察结果,以肉眼可见清晰凝集现象之血清最高稀释度(+)为凝集反应效价,必须达到原血清效价之半。
菌种保存
菌种应冻干保存。冻干后抽样按上述各项要求进行检查,合格后可作为种子批菌种用于生产。
种子批菌种可低温保存或置2~8℃冰箱中,生产前应检查菌种的全部特性,合格后方可用于生产。
2 制造
菌种
将生产用种子批菌种启开后,接种在10%羊血琼脂或其他适宜培养基上,放35~37℃二氧化碳环境培养一般不超过18小时,第2~4代菌种可用适宜的固体或液体培养基,35~37℃固体培养基培养不超过18小时,液体培养基培养不超过12小时。菌种自启开后最多不能超过5代。
培养基
生产多糖菌苗可选用适宜培养基。生产用的液体培养基不应含有能与加入的十六烷基三***溴化铵形成沉淀的成分。培养基中不应含有对人体有害或其他过敏物质。
培养
采用培养罐液体培养,在培养过程中及杀菌前取样进行纯菌试验,涂片做革兰氏染色镜检,如发现污染杂菌,应废弃。培养物于对数生长期后或静止期前期收获。一般培养6~8小时(随菌种接种量及使用培养基种类的不同而异)为宜。
杀菌
培养物加入甲醛溶液杀菌,或加热56℃10分钟,以确保杀菌完全及不损伤流脑多糖为宜。
去核酸
杀菌完成后,离心去菌体收集上清液,于其中加入十六烷基三甲溴化铵,充分混匀形成沉淀。放置适当时间离心,收集沉淀物。沉淀物中加入***化钙溶液,使其最终浓度为1mol/L,摇动或搅拌1小时,使多糖十六烷基三***溴化铵解离,加入乙醇至最终浓度为25%(ml/ml)。冷库静置1~3小时或过夜,离心去沉淀,收集澄清的上清液。
沉淀多糖
于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80%(ml /ml),充分振摇。使多糖沉淀,离心收集沉淀多糖,然后用无水乙醇及两***各洗二次以上,将沉淀物(多糖粗制品)保存在-20℃以下待进一步提取。
多糖的精制
将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中,使其浓度达10~20mg/ml,然后按1∶2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml1∶10饱和醋酸钠溶液)提取2