western常见问题分析.doc

1. 在western实验中,通常有人采用TBS,有人采用PBS,在使用中有什么区别?
选择合适的缓冲液对于维持一定PH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性是很重要的。PBS的缓冲能力强于TBS(因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围),(不过PBS易污染)。但我们常常要根据我们实验目的选用合适的缓冲液,如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析,阳离子缓冲液首选TBS;阳离子交换层析时,阴离子缓冲液则首选PBS。
western blot中使用TBS和PBS均可,只是要根据需要选择合适的浓度。
2. 没有注明可以用来做western blot的一抗,可以用来做western blot吗?
不一定,因为有的抗体是识别线性表位的,有的是识别构象型表位的,识别构象型表位的抗体不能用于western blotting,因为在western blotting中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原,而蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏。
3. 做western每次只加一种一抗,可以同时加两种或者多种一抗的吗?
最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话,就说不清楚了。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照,也是先上目的蛋白的一抗、二抗,ECL显色、压片、洗片;漂洗以后,再上内对照的一抗、二抗,ECL显色、压片、洗片。
4. western blot 使用的膜哪种最好啊,PVDF好还是NC膜,如何选择?
PVDF膜价格较贵,可重复使用,特别适合蛋白印迹,结合能力较强,但价格比较昂贵。 NC膜价格比较便宜,应用较广,结合牢固性差一些,韧性也不如PVDF,不能重复使用,但蛋白吸附容量高,亲水性较好。都可以用丽春红染色。具体使用还要参考相关文献。
5. 为什么出现了多条带,每个加样槽中都出现了多条带,而且好象都很有规律,为什么?是封闭时间不够吗?做WESTERN必须要内参吗?
一抗、或二抗抗体浓度太高,多克隆抗体本身的非特异性反应,抗体的特异性不强,目的蛋白经过处理后发生变化,,,内参是必须做的。
6. western用的一抗,单抗好些还是用多抗好些?用于western的抗体和用于ELISA的抗体有什么不同的要求?
作为western来讲,理论上单抗比多抗的特异性要好,但单抗种类较少一般价格偏高,所以一般来说多抗足够了。用于western的抗体和用于ELISA的抗体,一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性;而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类,有些是识别氨基酸序列特异性,有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。
做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题,一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白,另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。
7. 半干转是否要求膜,滤纸,胶同样大小?因为胶大小不一定规则,膜和滤纸会大一点,那样会不会短路?什么是短路?如何控制和发现短路呢?
可以相等,但是如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了,上下两层虑纸也不能因过大而相互接触,这样同样会短路,电流不会通过胶和虑纸。转移前和转移过程中看看电压就行,正常的半干是慢慢变高的, -3倍都是正常的。一般Buffer和滤纸选的对就不会短路。
8. Western Blot哪种染色好?
(1) 阴离子染料是较常用的,特别是氨基黑,脱色快,,考马斯亮蓝虽然与氨基黑有相同的灵敏度,但脱色慢,背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去,以便进行随后的氨基酸分析。缺点是:溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。
(2) 胶体金,灵敏度高,检测范围可到pg级,但染色比稳定。
(3) 生物素化灵敏度位于1、2之间,可用于任何一种膜。
9. 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上, 转移效率低怎么样解决?
可以考虑:转移缓冲液中加入20%甲醇(是指终浓度)(优化的转移缓冲液,可以参考《蛋白质技术手册》),因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率,但可增加蛋白质和NC膜的结合能力,甲醇可以防止凝胶变形,甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间;%SDS,也是为了增加转移效率;用优质的转移膜,或使用小孔径的NC膜();使用戊二醛交联;低浓度胶,如低至6%。太大时还可以考虑用琼脂糖胶;提高转移电压/电流;增加转移时间。
10. DAB显色、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色原理是什么?
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