小鼠脾单个核细胞的分离-20141113硕士班..ppt

小鼠脾单个核细胞的分离——密度梯度离心法
2014-11-13 硕士班
免疫细胞
所有参与免疫应答以及与免疫应答相关的细胞均被称为免疫细胞。
包括淋巴细胞、单核-巨噬细胞、DC、各种粒细胞、红细胞、肥大细胞、干细胞。
免疫细胞的种类
免疫细胞分离方法:
根据不同免疫细胞表面标志: FACS;MACS
根据细胞理化性质:
1)根据细胞比重差异:
自然沉降法; 密度梯度离心法; 改变细胞密度法
2)根据细胞黏附特性:B细胞黏附于尼龙棉
3)根据细胞对渗透压变化的敏感度:红细胞对低渗敏感
密度梯度离心法原理
根据物理学中颗粒沉降原理,不同密度的物质颗粒在其沉降运动中可因其比重的差别而处于不同的分布位置。利用此原理可设计一定比重的液体界面,将外周血中各种不同比重的细胞通过离心沉降而达到使其彼此分离的目的。
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人外周血各类细胞的密度各不相同,血浆和血小板的密度较大,;单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞,。± g/L 的等渗葡聚糖-泛影葡***(Ficoll-Urografin)分层液(又称Ficoll-Hypaque分层液、淋巴细胞分层液)进行密度梯度离心,可使血液中的各组分按密度不同梯度重新分布聚集。单个核细胞因密度略低于分层液,主要位于分层液和血浆的分届面上,收集此层乳白色细胞,即可获得较高纯度的单个核细胞。
密度梯度离心法
本次实验亦根据颗粒沉降原理,将不同密度的小鼠脾脏细胞置于淋巴细胞分离液上水平式离心,使单个核细胞在其沉降运动中位于分离液界面上;达到分离小鼠单个核细胞的目的。,。因此,± 的淋巴细胞分离液通过密度梯度离心的方法,可从小鼠脾脏细胞中分离得到单个核细胞。
密度梯度离心法
器材
(1)水平式离心机
(2)显微镜
(3)血球计数板、血盖片
(4)一次性试管、滴管
(5)擦镜纸、卷筒纸、镊子
试剂:
(1)小鼠脾脏细胞悬液
(2)淋巴细胞分离液(市售,比重:±)
(3)生理盐水
(4)白细胞稀释液
(5)%锥兰生理盐水溶液
操作步骤
将1ml小鼠脾细胞悬液混匀,用滴管沿盛有2ml淋巴细胞分离液的
试管壁轻轻铺于分离液面上
↓
将该试管置水平式离心机中离心(2000rpm)15 min
↓
用滴管小心地直接插入白色絮状的细胞层(含单个核细胞),
吸出界面层细胞,移入另一离心管内
↓
加入足量生理盐水,用滴管轻轻上下冲洗混匀
↓
离心(1000rpm)10 min
↓
弃去上清液,将沉淀细胞充分摇匀,加生理盐水,洗涤 1 次
↓
离心(1000rpm)10 min
↓
弃去上清液,将沉淀细胞充分摇匀
↓
(约6滴),摇匀
↓
取细胞悬液一滴加入等量白细胞稀释液于另一试管中充分混匀,用计数板在显微镜下计数,
计算出白细胞总数(/ml)
稀释的脾细胞悬液

稀释的脾细胞悬液
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