实验五：分子杂交.ppt

实验五微生物群落结构分析中的分子杂交技术
上海交通大学微生物分子生态学
与生态基因组学实验室

实验原理:
群落结构探针杂交的原理:
复杂环境样品,通过LP-RAPD获得的指纹图谱,电泳相同位置的条带,序列可能不同
直接以LP-RAPD指纹图谱分析群落结构之间的相似性,会高估其真实相似性
LP-RAPD产物标记为混合探针
与LP-RAPD指纹图谱杂交,通过杂交图分析
实验目的
在序列水平上平行比较微生物群落结构的差异
动态检测某个微生物群落结构的动态变化
Southern-Blot (***DIG-dUTP)探针
实验
主要实验材料
分析比较10 例儿童和4例仔猪肠道微生物LP-RAPD指纹图谱的差异
DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I(Roche, Germany)
真空转迹系统(Biometra,Germany)
杂交箱(Thermo Hybaid,UK)
实验过程:
探针标记
DIG-dUTP PCR labeling mix——直接扩增标记

Klenow 酶随机引物标记
PCR产物直接过柱纯化,测定浓度
~3 g PCR纯化产物+ 4 l标记 mix
标记反应: 37C, 20 h
实验过程:
电泳待杂交的样品
上样量一致
转膜
溶液1(去嘌呤液):7min,部分去嘌呤,易于变性
溶液2(变性液): 7min, 使双链DNA完全变性,尼龙膜和NC膜只结合单链DNA
溶液3 (中和液): 使PH值恢复中性
溶液4 (转移液20SSC):DNA在中性高盐条件下,转移到膜上
固定
UV固定:254-312 nm,5 min , 20 cm
真空80C烘烤 2 h
预杂交-至少3 h
目的:封闭尼龙膜上未结合DNA的空白处
预杂交液组成:
试剂盒( High Prime Hyb)
自己调配的
实验过程:
杂交液
100 ml
终浓度
20×SSC
25 ml
5 ×SS C
10% SDS
1 ml
%
10% SGS
1 ml
%
100 ×Denhardts
5 ml
5 ×Denhardts
鲑精DNA
5 mg
50 g/ l
定容至100 ml
杂交
变性DNA探针(沸水中煮10分钟)大约500 ng,立即置于冰盐混合物中
用含有探针的杂交液(25ng/ml)更换预杂交液,60℃杂交至少12 h
杂交完毕后,回收含有探针的杂交液,贮存于-20℃,每次用之前68℃变性10 min
洗膜
①杂交完毕后,先用50 ml 2×SSC,% SDS室温洗膜两次,每次15 min
②再用50 ml ×SSC,% SDS 68℃洗膜两次,每次15 min,最后进行显色反应
注意:洗膜的严谨度,影响杂交背景, 68℃为严谨条件
实验过程:
显色
抗原抗体反应
***-半抗原
抗体连接物上带有碱性磷酸酯酶
分解显色底物NBT/BCIP,而显现出颜色反应
显色步骤:
①在Washing Buffer 中简短洗膜1-5 min;
②在100