cxc趋化因子配体-10表达、纯化及动物实验研究-肿瘤学专业毕业论文.docx

CXCLl0触袭选、纯化及动物蜜验研究 四川大学j临床暇学博士专业学位论文
cxc越他嚣子配体19的表达、纯化爱动物实验爨究
研究生: 攀刚
铎 师: 魏于全教授措鼯枣缀: 蟹聆勰鬻磷究虽
罗峰剿教授肖飞剐教授
中文摘要
懋性肿瘤是一类常见的疾病,严重威胁着人熬的健康翻生命。尽管瑟登嚣镪不额溪溪,浚疗方寨不凝瑟瑟,馥疗仍然莛嚣戴溪攀澳疗瓣瘩豹主滚。版铂(DDP)跫广泛搜熙熬~线毒性他疗成分。蹶镶瓣使用弱照提高了患畿鲍完全缓髂攀和长期生存率,但是仍搿不少患者l圭;l于辨瘤复菱藤弼亡,鼯蘩楚添疗稽续逡嚣,零爱柩当跑镄黪患者爨然复麓。近来一些礤究表明,煌绞戆化疗或砻救疗策珞联台拨血管治疗可以产生更好的抗肿瘸效果。
CXC趋纯蕊孑鼯体10(CXCLl0),又名7干貔素诱警餐囱。10(IP- 10),主簧走于救豢、毖多糖等绷激单孩缨臆、内皮缨骢、怒攘缨胞疆产生。在脾瘤中除了展示胸腺依赖饿的抗肿癣幸挈用以外,还怒~种有效蕊囊警澎戏季牵裁裁。露蓠研究袭翳攀爱CXCLl0蛋鑫或基溺浚疗麓有效嫩鄹粼瓣癯生长,毽并不能造袋霆孛溪完全湾避,提示蔫癸枣}充药物整接靶向肿瘸细胞。CXCLl0与化疗药物联台应用治疗肿瘸的研究国内外稳泰觅报瀵。I蘸锫遴避与DNA链结合,形成交叉联结,掷靠《DNA、 RNA合成。CXCLl0雾辩颞铂辫其露较强豹摭黪瘸效瘟,簿游蘸兹的幸箬
用桃制和潦性不阕,本研究设想CXCLl0联合顺铂可以改藩辨瘤的治疗效鬃。
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方法:
本研究曾先获InvivoGen公司购买鹣pBLAST蕨粒上透过PCR扩增出入和鼠的CXCLl0序列(序列号;入x02530:鼠m33266),克隆到融合
(a)袋达重组蛋白。通过AKTA蛋白纯化系统纯化重缀蛋自,爨缀蛋塞质定擞矗按Novagen公司说明,攘入瑟激酶馋酶甥。复性后通过淋巴细胞趋优活性分析检测CXCLl0黧物活性。
在BALB/c(接种结肠癌CT26细胞)和C57BL/6小鼠(接种lewis 黪藏癌LL/2缯魏)上建立动甥模型。蔫痞小鼠穗税分蠹CXCLl0+DDP 组;CXCLl0组;DDP缀;PBS对照组,CXCLl0按25/.tg/kg/day,皮下注射,适用30天。顺铂采用腹腔内注射(5mg/kg),于CXCLl0治疗豹第14,2l天使瑗,逡羯嚣令蹋鬟。竣察,l、鼠黪瘸侮积帮生存瓣闻。
通过藻酸盐包被实验和CD31免疫组化观察肿瘤血管生成情况。通过 TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡。同时观察蛋白质可能的副作用。壤果:
CXCLl0克隆到pET-32(a)原梭表达载体上厝行酶切鉴定,然后将重组质粒缀DNA测序,证实所插入CXCLl0綦因序列与GenBank序列完全一致,开敦阕读糕黎正确。转纯大弱轷蘩BL21圆E3),经12 mmol/L的IPTG诱导表达2小时,然后作Tricine一聚丙烯酰***凝胶电泳
(Tricine-PAGE)分析,与诱导前相比,于分子量29KDa处均出飙了一条毅熬蛋鑫鼷表达条带,与颈袭分子鼙太小一致。表达豹CXCLl0蛋叁囊主要位于沉淀中,为不溶性的包涵体。利用AKTA蛋白纯化系统在A280 紫外监测仪控制下收集纯化的重组鬣白质,在200mmol/L咪唑() 洗篪时凄瑷夔缝蛋童熬浚蕊峰,终彀泳分菝和免痰露邃(Western Blot) 证实为目的基因表达的疆白质。经肠激酶切割和簸性后,
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验研究。
动物实验结果表明重组蛋自质在两种模裂上显著地抑制了肿瘤生长,健麓癯,l、鼠生存翳延长,嚣PBS_jc季照缓,』、鼠生移鬟饔爨缚短,嚣爨比较经统计躺处理差异商显著性()。两种肿瘤模型诞实了 CXCLl0联合顺铂相对单一成分治疗更加有效地降低了肿瘤的生长和延长了,l、鬣酶戒活对游,侄穗无,l、鬣瓣瘙完全消退。渗疗结寒惹4天,攮取Lewis肺癌各组小鼠的肺脏计算肺表面的肿瘤转移结节数,结果发现 CXCLl0治疗明显抑制了LL/2肺转移,在单用CXCLl0和联合治疗组肺袭嚣鹣蒡孛瘤终节计数多子对照鳃(P|《。.05>。HE缱织学锈片墩显示 CxCLlO治疗与对照组有明显差异。单用DDP治疗转移结节数商所减少,但与PBS对照相比,疑统计举处理灌异无胜著性(P=-0,12)。
藻羧釜实验结暴显示PBS缀哥冤丰富豹不蕊蠢静盘管,荤焉蟹鑫震治疗或者联合治疗组可见周围及内部新生血管明显少于PBS组, FITC— Dextran的摄取实验与此一致,经统计学处理,差肄有虽著性(产<0。05)。
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