cxcr4在肺癌侵袭转移中的作用及其机制-免疫学专业毕业论文.docx

CXCR4在肺癌侵袭转移中的作用及其机制 中文摘要
第一部分CXCR4与肺癌侵袭转移关系的研究
一、不同转移潜能肺癌细胞株趋化因子,趋化因子受体的表达趋化因子是一个大家族,根据N端半胱氨酸的数目和排列方式不同,分为
、c和cx3c四个亚家族。趋化因子受体属于7次跨膜的G蛋白耦联受体,R、CR和CX3CR四大类。为了寻找在肺癌侵袭转移中可能有意义的趋化因子和趋化因子受体,我们通过 RT-PCR检测了肺癌高、低转移细胞株中4种与血管生成有关的趋化因子和15 种有代表性的趋化因子受体。结果显示,在所检测的4种趋化因子中,趋化因子 GRO,n在肺癌高、低转移细胞株转移株上均有表达,同时15种趋化因子受体中, 只有趋化因子受体CXCR4的明显表达。迸一步半定量分析表明,、低转移细胞株之间无差异,而CXCR4高转移潜能细胞株的表达高于低转移潜能细胞株。
二、CxcR4在肺癌高低转移细胞株的差异表达为了进一步确定其表达特点,我们分别以实时定量RT-PCR和FACS分析
CXCR4的表达。实时定量RT-PCR结果发现CxCR4在肺癌高转移细胞株95D 的表达明显高于肺癌低转移细胞株95C(尸<)。CXCR4是细胞表面的7次跨膜的G蛋白耦联受体,我们继而通过FACS检测其表达,结果同样证实了CXCR4 在95D细胞的表达高于95C细胞。
三、CxcR4在肺癌细胞的功能性表达通过钙离子内流实验和趋化实验来进一步明确肺癌细胞表达的CXCR4是否
具有功能。我们检测了其特异性配体SDF一1 a作用于肺癌细胞后胞内钙离子浓度的变化情况,以钙离子荧光指示剂Fluo-3/AM负载细胞,检测了不同浓度的 ,结果显示100ng/ml Ⅱ即可引起较强的钙离子内流,表明SDF一1 Q以剂量依赖性的方式引起肺癌细胞胞内钙离子内流。这种钙离子内流是短暂而迅速的,在100ng/ml a刺激后的20s 前后检测到胞内平均荧光强度显著增强,随着时间的延后,平均荧光强度迅速下降, a以时间依赖性的方式引起肺癌细胞胞内钙离子内流。、95C细胞发生不同程度的趋化。这些结果提示CxCR4功能性表达于肺癌细胞。四、CXCR4在临床肺癌组织的表达
为进一步探讨肺癌细胞功能性表达的CXCR4与肿瘤发生、发展的关系,我们收集36例临床肺癌组织标本,并进行免疫组织化学染色和RT-PCR。免疫组化染色按肿瘤细胞阳性细胞率和着色强度分别进行记分,以两者记分乘积表示肺癌
复旦大学博士学位论文
CXCR4在肺癌侵袭转移中的作用及其机制中文摘要
细胞CXCR4表达水平。在所检测的36例肺癌组织标本中,所有癌周围的正常
肺组织均为CxCR4免疫组化染色阴性:有2例肺癌组织表现为CXCR4免疫组化染色阴性;其余34例为免疫组化阳性,且表达水平不一(+~卅)。癌细胞所表达的CXCR4主要定位于胞膜和胞浆。同时发现CXCR4强阳性(卅)表
达多见于临床资料显示有转移的肺癌组织。统计学分析显示,表明CXCR4的表达水平与肺癌细胞的转移与否存在一定的关系(P<),而与肿瘤的组织学类型和分化程度无关。同时RT-PCR结果发现:与正常肺组织相比,在所检测的4 例肺癌组织中均有较高水平的CXCR4 mRNA表达,而且在l临床有转移肺癌组织的表达高于未有转移的肺癌组织,进一步提示了CXCR4的表达水平与肺癌细胞的转移与否有关。
第二部分CXCR4在肺癌侵袭转移中的作用
一、CXCR4正义和反义真核表达重组质粒的构建和鉴定为了研究CXCR4在肺癌转移中的作用,我们通过过表达技术和反义技术来
调控CXCR4的表达以观察对肿瘤恶性生物学行为的影响。首先构建CXCR4全长真核表达质粒。经RT-PCR克隆CXCR4全长编码基因,获得约1353bp大小的产物,将PCR产物以EcoRI和XbaI双酶切后,以T4DNA连接酶与经过同样酶
切的pcDNA3连接,转化后,经EcoRI和Xbal酶切和测序分析,显示克隆的目的基因序列与报道序列完全一致,读码框架正确,。接着构建靶向CXCR4 5’。经RT-PCR获得约56lbp大小的产物,以T4DNA连接酶与pUCmT载体连接并转化。经EcoRV/BamHI酶切和PCR显示目的基因已连接入pUCmT载体,方向正确。PUCmT-ASX4进一步经EcoRV和BamHI酶切,回收酶切产物,以T4DNA 连接酶与经过同样酶切的peDNA3连接,转化后,经EcoRV和BamHI酶切、PCR 鉴定和测序分析,显示方向和