大肠杆菌基因工程.ppt

基因工程原理
何光源
2016-04-05
第九章大肠杆菌基因工程
第一节大肠杆菌表达体系
第二节大肠杆菌的表达载体
第三节克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达
2018/6/25
第一节大肠杆菌表达体系
2018/6/25
第一节大肠杆菌表达体系
大肠杆菌表达体系
克隆基因正确表达的基本条件
2018/6/25
大肠杆菌表达体系
基因工程的重要目标之一是,制备按其它方法难以生产的大量纯化的蛋白质产物,为此就需要有一种能够高水平表达异源蛋白质或重组蛋白质的表达系统。而良好的表达系统的选择要考虑多方面的因素,如寄主细胞的生长特性、蛋白质产物转译后的修饰与生物活性,以及异源蛋白质的表达水平和分泌方式等。目前被选作表达异源蛋白质的表达系统有细菌(包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞等。
2018/6/25
大肠杆菌表达体系
比较而言,大肠杆菌表达系统具有明显的优越性:
对大肠杆菌的背景知识,特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解;
一种安全的基因工程实验体系,拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体;
许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达;
培养方便、操作简单、成本低廉,易于进行工业化批量生产。
2018/6/25
大肠杆菌表达体系
大肠杆菌中表达体系表达真核基因的不足:
真核基因在结构上同原核基因之间存在着很大的差别,在大肠杆菌细胞中不可能具有为真核RNA加工剪辑所需要的酶体系,真核基因很难直接在大肠杆菌细胞中实现功能性表达;
真核基因的转录信号同原核不同。细菌的RNA聚合酶不能识别真核启动子;外源基因可能含有具有大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。
真核基因mRNA的分子结构同细菌有所差异,影响真核基因mRNA稳定性和同细菌核糖体相结合的能力,从而阻碍正常的转录和翻译;
2018/6/25
大肠杆菌表达体系
许多真核基因的蛋白质产物,都要经过转译后的加工修饰(正确折叠和组装),而大多数的修饰作用在细菌细胞中并不存在;
细菌的蛋白酶,能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子,将其降解。
2018/6/25
大肠杆菌表达体系
为了克服上述这些问题,已经发展出了许多种不同的方法:
将克隆的真核基因插入到原核启动子的下游附近部位,如大肠杆菌Lac操纵子的lac启动子,Trp操纵子的trp启动子及tac启动子,λ噬菌体的PL和PR启动子以及pBR322载体的β-内酰***酶启动子
从真核细胞中分离完成加工的mRNA,使用反转录酶合成出cDNA,并连接到适当的载体上,可以克服真核基因的间隔子问题;
根据蛋白质的氨基酸序列,应用化学方法合成出不带间隔序列的寡聚脱氧核糖核酸的短片段;
通过引进突变的的方法消除细菌中存在的能降解外源真核蛋白质的蛋白酶分子。
2018/6/25
克隆基因正确表达的基本条件
最基本条件:能进行正常的转录和翻译,在正常情况下还与翻译后加工及新生多肽在细胞中的分布有关。
重要条件
编码的蛋白质产物应能维持正常的稳定性;
具有核糖体结合位点;
具有克隆基因的功能(强)启动子;
插入序列的正确取向
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