腺相关病毒生产流程.docx

上文已经介绍了腺相关病毒的基础知识,具有如此多优点、功能如此强大的腺相关病毒是如何生产的?本文将为大家揭开腺相关病毒生产的神秘面纱。
腺相关病毒生产流程大致可分为基因克隆、细胞转染、收毒、病毒纯化、滴度检测等步骤,具体步骤我们下文分解?怎么可能,下面就是腺相关病毒生产流程。
 腺相关病毒重组克隆载体构建
1)根据订单不同选择不同的载体,在此以人源基因克隆为例。
2)Vigenebio 公司的 AAV 载体与我们的人源 ORF (注:维真生物拥有18000人源cDNA ORF克隆,可以最快的时间克隆到载体)库中的穿梭质粒的多克隆位点相兼容,通过酶切,连接,转化的方式将基因亚克隆进入 pAV-FH AAV 载体,得到阳性克隆之后进行酶切跑胶验证及测序以确认插曲片段的正确性。
细胞冻存流程
1) 按照培养细胞流程,将细胞吹下来加入 50ml 离心管中, 800g 离心5min。
2) 配制冻存液,90% 血清,10% DMSO,混匀。
3) 离心后去上清,将配制的冻存液加入,将细胞吹匀
4) 取上述溶液 1ml 分至 细胞冻存管中,做好标记和日期。
5) 放入装有异丙醇的冻存盒中,放入-80度冰箱过夜。(冻存盒要提前一天从冰箱中拿至室温,使异丙醇的温度达到室温,每次冻存前确保异丙醇的加入量在刻度线上)。
6) 第二天将冻存盒放入液氮或-150℃冰箱中。
细胞复苏流程
1) 10cm 培养盘中加 10cm 新鲜 DMEM 培养基,放培养箱预热至 37℃。
2) 从液氮中取出冷冻管,迅速投入37 ℃~38℃水浴中,使其融化(1-2 分钟左右)。
3) 待细胞冻存管中溶液尚未完全融化时加入预热的培养盘中。
4) 摇晃均匀,放培养箱培养。
5) 4h后待细胞完全贴壁后更换新鲜培养基(除去冻存液中 DMSO 对细胞的毒害作用。也可在第 3步中 800g 离心 5min,除去培养基后再悬浮细胞添加至新鲜预热的 DMEM 细胞培养皿中)。
 细胞培养流程(以 10cm 细胞培养皿,传代为例)
1) 生物安全柜紫外灭菌半小时。
2) 灭菌期间,DMEM 培养基(含 10%FBS,1%青链霉素混合液)、PBS 以及 %胰酶在 37℃水浴锅中预热。
3) 取汇合度接近 100%活性好的的 HEK293T 细胞,吸弃培养盘中培养基,加约 5ml,1×PBS,摇晃几下,吸弃PBS。(加 PBS目的主要除去残留在皿中的培养基中的 FBS,以提高胰酶的消化效率)
4) 加 1ml % 胰酶在生物安全柜内消化约 1min,室温低时可放置于培养箱中消化。消化时间不宜过长,否则影响细胞再次贴壁效率和活性。
5) 加入约 5ml 的预热的培养基。
6) 用移液管吹打均匀,按照 1:3 比例传代。各洗 2ml 培养基至新的 10cm 皿中,再加入8ml 预热的 DMEM 培养基。(吹打过程中不可用力过大,否则会吹破细胞)。
注意:传代盘数较多时,要先将预热的 DMEM 培养基加入到 10cm 皿中,再加入含细胞的培养基,以避免细胞分布不均。放置于培养箱前轻轻混匀皿中的培养基,使细胞均匀分散于培养基中。细胞培养条件为 5%-7%CO2 浓度,37℃,培养箱内无菌水盘内水份提供一定的湿度。
细胞传盘以及分 6 孔板,2