Western blot.doc

Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答)
Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。
Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。其原理是:生物中含有一定量的目的蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白,将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中,经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离,再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜(***纤维素膜或尼龙膜)上,接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育,以封闭其非特异性位点。然后加入特异抗性体(一抗),膜上的目的蛋白(抗原)与一抗结合后,再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗(通常一抗用兔来源的抗体时,二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体),最后通过二抗上带标记化合物(一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的特异性反应进行检测。根据检测结果,从而可得知被检生物(植物)细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:
一、原理
二、 分类



(本实验室使用)
三、 主要试剂
四、 主要步骤
1上样与电泳 
冷却到室温后,把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。 
为了便于观察电泳效果和转膜效果,以及判断蛋白分子量大小,最好使用预染蛋白质分子量标准。 
电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳,而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置 或类似电泳装置,低电压可以设置在80-100V,高电压可以设置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求, 也可以采用碧云天的多功能电泳仪(带定时)。为了电泳方便起见,也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式,通常把电压设在 100V,然后设定定时时间为90-120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳,或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况,预计目的蛋白已经被适 当分离后即可停止电泳。 
3. 转膜(Transfer) 
我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。***纤维素膜(NC膜)也可以使用,但***纤维素膜比较脆,在操作过程中特别是用镊子 夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。 
通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置,可以设定转膜电流为300-400mA,转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过 夜。转膜时也可以使用碧云天的多功能电泳仪(带定时)。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的转膜时间越长,目的蛋白的分子量越小,需要的转膜时间越短。 
在转膜过程中,特别是高电流快速转膜时,通常会有非常严重的发热现象,最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。  转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准,通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进