双酶切及连接.ppt

目录
原理
类型
命名法
实验
注意事项
连接
常见问题及对策
DNA的限制性酶切实验原理
核酸限制性内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶,这些酶都是从原核生物中发现,它们的功能犹似高等功物的免疫系统, 用于抗击外来DNA的侵袭。
限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键, 产生的DN***段5’端为P,3’端为OH。
根据限制酶的识别切割特性, 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
限制性内切酶的类型
限制性内切酶的类型
第一类(I型)限制性内切酶:能识别专一的核苷酸顺序,它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链,但是切割的核苷酸顺序没有专一性,是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大,无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。
第二类(III型)限制性内切酶:也有专一的识别顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此,这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DN***段,具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。
限制性内切酶的类型
第三类(Ⅱ型)限制性内切酶:就是通常指的DNA限制性内切酶.
它们能识别双链DNA的特异顺序,并在这个顺序内进行切割,产生特异的DN***段;
Ⅱ型酶分子量较小,仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子,识别顺序一般为4~6个碱基对的反转重复顺序;
Ⅱ型内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口--5’端突出;3’端突出和平末端。
正是得益于限制性的内切酶的发现和应用, 才使得人们能在体外有目的地对遗传物质DNA进行改造,从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。
限制性内切酶的类型
粘性末端:是交错切割,结果形成两条单链末端,这种末端的核苷酸顺序是互补的,可形成氢键,所以称为粘性末端。
如EcoRI的识别顺序为:
5’…… G|AATTC ……3’
3’…… CTTAA|G …… 5’
在双链上交错切割的位置切割后生成
5’……G AATTC……3’
3’……CTTAA G……5’
各有一个单链末端,二条单链是互补的,其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。
II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链,产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是:
5’…… GAT|ATC …… 3’
3’…… CTA|TAG …… 5’
切割后形成
5’…… GAT ATC …… 3’
3’…… CTA TAG …… 5’
这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。
平头末端:
用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称,如E. coli 用Eco表示,所以用斜体字。
用一个字母代表菌株或型,如流感嗜血菌(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d,即Hind。
如果一种特殊的寄主菌株,具有几个不同的限制与修饰酶,则以罗马数字表示,如HindⅠ, HindⅡ,HindⅢ等。
限制性核酸内切酶的命名法
实验材料及仪器
高速离心机,电炉,电泳仪,制胶槽,电泳槽,梳子,锥形瓶,量筒,移液枪,冰盒,枪头,Ep管,手套,记号笔,TAE电泳缓冲液(10×),琼脂糖,溴化乙锭(EB),质粒DNA