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植物DNA的提取与纯化 DNA extraction
实验一
实验原理
植物DNA的分离是分子生物学、遗传学和育种学等植物科学研究的基础要求。对DNA提取一般有三个要求:
1. DNA的纯度可以满足下游操作的要求
2. DNA必须完整
3. DNA应当有足够的量
一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb,在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。
如果对植物进行大规模筛选,操作程序应当快捷,简便,价格低廉,并尽可能避免使用有毒试剂。
核酸的理化性质
RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶,DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外,核酸和核苷酸大都呈酸味。
DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物,一般都溶于水,不溶于乙醇、***仿等有机溶剂,它们的钠盐比游离酸易溶于水,RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L,呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中,DNA、RNA易水解,在中性或弱碱性溶液中较稳定。
天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时,先把DNP抽提出来,再把蛋白质和糖去除,同时除去RNA及无机离子等,从中分离DNA 。
提取植物DNA的方法主要采用SDS和CTAB法,对它们进行稍加修改就可以应用于DNA的微量提取。两种方法均采用去污剂裂解细胞并保护DNA不受内源核酸内切酶降解。
具体方法简单说来就是利用液氮对植物组织进行研磨,从而破碎细胞。细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜,使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、***仿抽提的方法去除蛋白,得到的DNA溶液经乙醇沉淀。
实验材料和试剂
实验材料:新鲜植物组织。
100 mmol/L Tris-HCl ()
50mmol/L EDTA
500 mmol/L NaCl
% SDS
DNA提取缓冲液
实验所需试剂:
24:1/***仿:戊醇
其它试剂:液氮、TE缓冲液,无水乙醇、70%乙醇。
2×CTAB buffer
100mM Tris
NaCl
20 mM EDTA
2% CTAB
% 巯基乙醇
酚/***仿(1:1)
***仿:50 ml
无水乙醇
实验仪器
实验步骤:
取新鲜叶片约3g, 剪碎, 加入液氮充分研磨后转移至2ml离心管中;
2. 在65℃ Bisufite, ;
3. 在管中加入适量提取液,60℃水浴保温约30min,不时颠倒混匀;
4. 冷却至室温后加入等体积***仿/异戊醇,用力摇匀后,放置摇床上摇动15min左右;
5. 室温下10000rpm离心15min,小心吸上清于新的离心管中,加入两倍体积的冷酒精,-20 ℃放置1h或过夜;
6. 挑出DNA置于新的管中,挑出有困难时可以低速离心后倒去上清。加入适量70%酒精,摇动洗涤10min,重复洗涤2-3次;
7. 吹干DNA,加入适量TE在65℃溶解,完全溶解后离心去除杂质;
加入RNase(10mg/mL), -1h, 除去RNA,4℃或-20℃贮存。
如需纯化DNA,再加入适量TE,***仿/异戊醇多次抽提后吸取上清,加入3ml/L NaAc和两倍体积的乙醇, -20 ℃放置1h或过夜;
吹干沉淀后,加入适量TE, 65℃溶解, 4℃或-20℃贮存。
1. 植物叶子约3g, 剪碎置预冷研钵中
加入液氮充分研磨,注意不能干磨
3. 60℃水浴保温30-60min