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生物化学实验讲义
常熟理工学院生物与食品工程学院
生物化学讲义
目录
目录 1
实验—分光光度计的使用(准备实验) 2
实验二考马斯亮蓝G-250比色测定蛋白质含量 4
实验三酪蛋白的制备及乳糖脎的制备 6
实验四 DNA与RNA的提取分离及颜色反应 7
实验五唾液淀粉酶活力的一些因素 9
实验六淀粉酶的活力测定及专一性实验 12
实验七 2,6-二***酚靛酚滴定法测定L-抗坏血酸的含量 14
实验八荧光光度法测定核黄素的含量 16
实验九 3,5-二硝基水杨酸比色测定糖的含量 18
实验十硅胶板的制备 20
实验十一硅胶G薄层层析分离可溶性糖 20
实验十二植物蛋白(大豆分离蛋白)的制备 22
实验十三聚丙烯酰***凝胶电泳测定蛋白质分子的相对分子质量分布 23
实验十四糖酵解中间产物的鉴定 26
实验十五细胞色素C(cytc)的制备 27
实验十六酵母蔗糖Km值的测定 28
实验十七学生自我设计实验 30
附录1 31
实验一分光光度计的使用(准备实验)
一、实验目的
通过电教方式学****分光光度计的工作原理
掌握比色法测定的操作方法
二、实验原理
利用各种化学物质(包括原子、基团、分子及高分子化合物)所具有的发射吸收或散射光谱系的特征,来确定其性质、结构或含量的技术,称为光谱分析技术。根据光谱谱系的特征不同,可把光谱分析技术分为发射光谱分析、吸收光谱分析和散射光谱分析三大类。
吸收光谱分析:可见光分光光度法(400-760nm)、紫外光分光光度法(<400 nm)、原子吸收分光光度法和红外分光光度法(>760 nm)
发射光谱分析:荧光分析法和火焰光度法
散射光度分析:比浊法
吸收光谱分析原理:当光线透过透明溶液介质时,其辐射的波长有一部分被吸收,一部分透过,因此光线射出溶液之后,部分光波减少。这种光波的吸收和透过可用于某些物质的定性定量分析。
吸收光谱分析法的常用方法:
标准曲线法:将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程显色后,分别测其吸光度,以吸光度为纵坐标、,浓度为横坐标绘制标准曲线。在相同条件处理待测物质并测定其吸光度,即可从标准曲线找出相对应的浓度。
三、器材与试剂
仪器
分光光度计放像机电视机
器材
普通试管:20mL×3
移液管:5 mL×2
烧杯:250 mL×1
洗耳球:2
洗瓶、试管架、移液管架:各1
试剂的配制
***钾(K2Cr2O7)溶液(): K2Cr2O7,蒸馏水溶解后定容至1000 mL。
四、重要步骤
a)在电教室中看录象
了解721型分光光度计的工作原理
b)在分光光度室中练****操作
详细步骤见附录2。
c)在实验室中应用练****br/>取三支试管,按下表所示顺序操作
管号
操作
空白
样品
0
1
2
***钾溶液(mL)


蒸馏水(mL)

比色
以0号管为空白参比,测定λ=450nm处的吸光度
记录吸光度
五、结果处理
1、求两个样品管A450的平均值A450
2、计算样品液中***钾的浓度C(单位用mg/mL)
其经验公式为:A450=-×10-3
六、思考题
1、到分光光度室中进行比色测定应携带哪些器材?他们分别起什么作用?
2、比色时,设一个“0”号管的意义是什么?
实验二考马斯亮蓝G-250比色测定蛋白质含量
一、实验目的
学****和掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法
二、实验原理
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量属于一种染料结合法。考马斯亮蓝G-250是一种蛋白质染料,它在游离状态下最大吸收波长为464nm。
由于它所含的疏水基团与蛋白质的疏水微区具有亲和力,通过疏水作用与蛋白质结合。当它与蛋白质结合后形成蓝色的蛋白质-染料复合物,其最大吸收波长变为595nm。这种结合在2分钟左右达到平衡,生成的复合物在一个小时内保持稳定。
在一定的蛋白质浓度范围内,蛋白质-染料复合物含量在595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比,所以用于蛋白质含量的测定。
该方法非常灵敏,蛋白质最低检测量为5μg,而且此法操作简便、快速,干扰物少,是实验室常用的蛋白质定量方法。但染料易吸附在比色杯(注意:不可用石英比色杯)上造成误差,操作时应及时用酒精清洗。
三、实验材料和设备
1. 材料
绿豆芽
2. 仪器
分光光度计离心机电子天平
3. 器材
普通试管:20mL×8
容量瓶:100mL×1
移液管:1mL×4 5mL×1
烧杯:250mL×4 50mL×1
离心管:100mL×1
滴管:2
洗耳球:2
坐标纸
研钵,洗瓶,试管架,移液管