生物学实验 血液基因组DNA 的纯化分离.doc

实验5血液基因组DNA 的纯化分离
【实验目的】掌握动物全血基因组 DNA提取的方法
【实验原理】真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内,而成熟的红细胞除禽类外没有细胞核,因此,制备DNA的原则是先要分离白细胞。提取DNA的一般过程是将分散好的白细胞在含SDS(十二烷基硫酸钠)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质,再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
【器材与试剂】

制冰机、冰箱、冷冻低温超速离心机、常温高速离心机、移液器,旋转摇床、恒温箱、恒温水浴箱、离心管架、真空干燥器、烧杯、试剂瓶、离心管和吸头等。
2. 试剂
(1) PBS-缓冲液:取NaCl 8 g,KCl g,Na2HPO4 g,KH2PO4 g,定容至1000 ml,高压灭菌
(2) 提取液:含10 mmol/L Tris-HCl (pH ), mol/L EDTA , % (m/V) SDS。
(3) 20 mg/ml蛋白酶 K溶液
(4) 平衡酚
(5) 氯仿
(6) 10 mol/L 醋酸铵
(7) 无水乙醇
(8) 70% (V/V) 乙醇
(9) TE缓冲液
【操作步骤】
冰冻的血样在室温水浴中融化。
10 ml全血转入一个无菌的50 ml离心管中。
加入1倍体积的PBS缓冲液并混匀稀释。
室温下,以3,500g 的相对离心力,离心15 min。
弃去上清液。
ml提取液使其悬浮。
然后37 ℃水浴 1 h。
加入25 μl 20 mg/ml 的蛋白酶K,在60~65℃的恒温箱中保温3 h。
加入1倍体积的酚(pH ),放旋转摇床口底晃动10~30 min, 以5,000g 的相对离心力,在4 ℃下离心 20 min。
水相移到一个无菌干净的离心管中。
,翻转摇动10 min,4 ℃下,以5,000g的离心力,离心 15 min。
水相移到一个无菌干净的离心管中。
加入1倍体积氯仿,翻转摇动10 min,4 ℃下以5,000g的离心力度,离心15 min。
水相用移液器移到一个无菌干净的离心管中。
加入