项目采购与合同管理 智库文档.ppt

实验二质粒的酶切和琼脂糖凝胶电泳检测
实验二质粒的酶切和
琼脂糖凝胶电泳检测
实验目的
实验原理
实验仪器、材料与试剂
实验步骤
实验结果及讨论
一、实验目的
限制性内切酶切割出目的DNA
了解琼脂糖凝胶电泳的原理
掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方法
二、实验原理
利用限制性内切酶具有特定的识别及切割位点,定点切割环状质粒DNA。
琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中常规的实验方法,它能检测少量的DNA(如用肉眼观察,可检测到10 ng的DNA),且检测的范围很广。
琼脂糖凝胶电泳对DNA分子的检测,主要基于在凝胶中加入溴化乙锭,这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物,使DNA在紫外光下发射很强的荧光,而在紫外光下DNA发出的荧光是可见光。在溴化乙锭足够的情况下,荧光的强度正比于DNA的含量,因而DNA的检测很方便。如将已知大小和浓度的标准样品(Marker)作电泳对照,就可估计出待测样品的大小和浓度。
三、实验仪器、材料与试剂
仪器
1. 水平式凝胶电泳槽
2. 稳压电泳仪
3. 电炉
4. 紫外检测仪
5. 台式离心机
材料
实验一中提取的质粒DNA和本实验酶切后的质粒DNA。
试剂
1. 限制性内切酶 EcoR I,HindIII(XholI)
2. 50×TAE电泳缓冲液():
Tris 242g
冰醋酸
EDTA() 100ml
稀释到电泳缓冲液1×TAE
3. 溴化乙锭溶液:10mg/ml水溶液,室温,棕色瓶或铝铂纸包装保存。
4. 10×(6×) ×DNA样品上样缓冲液(Loading Buffer,溴酚蓝指示剂, DNA样品加样缓冲液)
5. 琼脂糖Agarose
或在20μL反应体系中,包括:
质粒pMD18-T 16 μL
EcoR I 1μL
HindIII 1 μL
Buffer M 2μL
ddH2O 0μL
37℃~ 小时。