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设计实验三、基因工程方法表达蛋白药物


实验目的:利用大肠杆菌、酵母或动物细胞表达体系表达一种蛋白药物或蛋白因子,发酵培养后进行提取。通过本实验,让同学们深刻理解基因工程药物的生产程序及其中的注意事项。
实验体系:根据实际情况,确定一种或几种蛋白类药物,由实验老师提供已构建好的表达体系,有条件的单位可以让同学自己制备表达体系。
需要同学解决的关键问题:
1、了解所表达蛋白的功能及其在实际应用过程中的优缺点。
2、充分查阅资料,了解所用表达体系的来源及优缺点。
3、分析发酵过程中的注意事项。
4、了解所表达蛋白的稳定性及现有的先进工艺,综合分析后确定提取工艺。
5、综合评定所表达体系的优缺点,提出可能的改进路线及方案。
举例说明:大肠杆菌表达干扰素的工艺
具体步骤:
1、查阅文献,了解干扰素的来源、种类、性质、应用以及干扰素的研究进展。了解目前准备发酵生产的干扰素的研究状况及可能的改进方法。
2、使用已经构建好的表达体系进行实验,首先要了解所使用表达体系的构建过程,所使用的表达质粒及菌株的特性。(有条件的实验室可以让同学独立构建干扰素表达体系)
3、查阅该表达体系使用的发酵条件。
4、了解基因工程菌株发酵过程中的注意事项。
5、进行实验分析溶氧、pH、温度、培养成分对于表达蛋白产量的影响。
6、优化条件后进行进行培养发酵。
7、确定提取、纯化干扰素的工艺路线。总结在提取过程中的注意事项:如需要加入巯基乙醇对于二硫键进行保护,加入苯甲基磺酰氟(PMSF)来抑制蛋白酶的活力。同时也要考虑比如说使用哪种絮凝剂等具体问题。
8、集体讨论文献中的提取方法有优缺点,从理论上讲是否有可以改进的地方。
9、发酵后提取干扰素,然后进一步分析提取效率。
10、同样,需要调研是否有新开发的提取方法用于蛋白药物的提取,是否有可能在本实验中使用。
11、提出目前使用的生产工艺的优缺点,结合文献,提出合理的、可能实施的改进方案。
参考文献:
李元主编,基因工程药物,2002年,化学工业出版社
马清钧主编,生物技术药物,2002年,化学工业出版社
李校坤(名简写),袁辉主编,2003年,暨南大学出版社