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细胞复苏及细胞鉴别与计数...doc


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细胞生物学实验报告
细胞复苏及细胞鉴别与计数
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Part1、细胞复苏
一、实验原理
细胞复苏是以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程。不论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存,并在适当条件下复苏。
复苏细胞原则:快溶。防止在融化过程中已融解水渗透入细胞导致的二次结晶对细胞形成损害。使培养物能快速通过对细胞有损害的-5~0℃摄氏度区域,细胞仍能生长,活力受损不大。
二、实验目的
掌握细胞复苏的基本方法
三、实验器材
(1)仪器 
CO2培养箱,显微镜、倒置显微镜,超净台 
(2)材料 
培养瓶,试管,移液管,废液缸,75%酒精棉球,酒精灯,冻存的Hela人宫颈癌细胞,滴管
(3)试剂 
完全培养基(DMEM),小牛血清,双抗
四、实验步骤
1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏,内装2/3杯40℃的温水。
2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟内融化。
3、将冻存管放入离心管中800rpm离心10分钟,取出冻存管拿入超净台中,75%酒精消毒管口,打开冻存管,弃上清。
4、沉淀加1ml完全培养基吹打细胞使之均匀,将细胞转移至25ml培养瓶中,补加3ml新鲜培养基于干净培养瓶中培养。
5、,%台盼蓝染色,取80µl细胞液镜下观察活力。
6、再向上述培养瓶中加入4ml10%含FCS及双抗的DMEM培养基,轻轻混匀,显微镜下观察。盖上瓶盖, 去倒置显微镜上观察细胞形态。做好标记。将瓶盖适度拧紧后再稍回转,以利于CO2气体的进入,将培养瓶放回CO2培养箱。
7、将用过的试剂仪器等摆回原处,将超净台打扫干净,关闭照明灯及抽风机。
8、实验后数小时后去观察细胞生长情况,并拍摄照片。
五、实验结果
传代后在显微镜下可看到细胞呈悬浮状态,全部为单个的分散的细胞。复苏后大部分细胞生长状态良好,透明度大,细胞内颗粒少,没有空泡,细胞形态完整。也存在少数颜色较暗的死细胞,无立体感,细胞通透性差,有颗粒状物质。
我们5小后对复苏后的人宫颈癌Hela细胞进行拍照,可观察到细胞复苏效果较好,多数细胞处于开始贴壁状态,细胞呈现扁平或梭型,透明度较好。仍有少数细胞成悬浮状态,未贴壁
(冻存的人宫颈癌Hela细胞复苏倒置显微镜20×)
Part2、细胞的计数与死细胞的鉴别
一、实验原理
细胞计数方法:血球计数板。
血球计数板:,。计数室的边长为1mm,,盖上盖片后计数室的容积为 。所以,可根据在显微镜下观察到的细胞数目,换算成单位体积中细胞的数量。
细胞计数:细胞压格计上线不计下,计左不计右,如有少量两个以上细胞按一个细胞计数,如超过10%说明消化不充分。
通常认为细胞膜丧失完整性,(Trypan Blue),而死亡的细胞,膜的完整性丧失,通透性增加,,细胞经台盼蓝染色后,可通过显微镜,直接镜下计

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