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用层析法分离、复性包涵体
谷振宇  Jan-Christer Janson  苏志国
中国科学院过程工程研究所
摘要
     这里提出了一种用柱层析直接从Ecoli破碎原浆中分离纯化及复性包涵体的新方法。将传统的离心分离一步凝胶过滤所取代。分离的原则是选择合适的介质,使之仅排阻包涵体颗粒,而其它的组份都可以进入并穿过凝胶介质。在新的复性方法中,逐步递减的变性剂(urea或Gu-HCl) 梯度与逐步递增的pH梯度相结合,通过凝胶过滤(排阻上限小于蛋白质分子量) 层析来进行复性。溶解在高浓度变性剂及低pH中的变性样品,
     然后加入到梯度形成好的层析柱中。在层析过程中,变性蛋白质的下行速度大约是变性剂下行速度的3 倍。因此,变性蛋白会经过已经形成好的变性剂和pH梯度,并逐步脱除变性剂,逐步地升高pH,这样可以促进正确的折叠。梯度的形状和程度,及流速都会影响复性率,而且可以针对不同蛋白质进行调节,以得到优化的条件。我们在此实验中选择的目标蛋白质为大肠杆菌表达的scFv 融合蛋白包涵体。
Rudolph和Lile的综述已经对蛋白质的体外复性做详细的介绍[1]。传统的分离、复性方法如:分步离心,稀释和透析通常很耗时且复性率低。本文中介绍了以凝胶过滤为基础发展起来的分离及复性方法。此方法的一个优势是变性剂的脱除,流速及pH的变化可以很容易的调节。大肠杆菌表达的scFv 融合蛋白质包涵体。ScFv 片段在Eocli 中表达量很高,但经常会形成包涵体。因此需要进行复性。
材料与方法
     脲(urea )、DTT、PMSF、溶菌酶(lysozyme)、精氨酸(arginine)、Triton X-100和DNAse购于Sigma。GSSG,GSH购于Roche。Berol 185 购于Akzo Nobel 表面化学公司,Sweden。所有层析介质均为Amersham Pharmacia Biotech公司产品。其它试剂均为分析纯。实验用水为Millipore 纯水系统生产。所有层析实验在AKTA Explorer 层析工作站上进行。用于scFv57P 活性检测的Biacore 2000 为Biacore(Sweden) 公司生产。电泳设备采用Amersham PharmaciaBiotech 公司的PhastSystem 电泳设备。
克隆与表达scFv57P
     Fab57P 的scFv 抗体片段是通过VH-linker-VL 的走向构建成pscFvHL57P [2]。载体选择用pscFew,它有一段可以使蛋白质表达到周质的pelB 引导序列;一个15-aa linker,VH-SRGKSSGSGSESKST-VL,来连接抗体可变区的两个domain;C-terminal 的B10tag 用于免疫识别[3] 。在pscFvHL57P 中VH domain 被设计成XhoI-XbaI 位点,PCR扩增目标片段,VL domain 被设计成SacI-SpeI 位点。PCR扩增目标片段。
    ScFv57P 中[4]。通过Western blot鉴定(用抗B10的抗体),发现表达的scFv57P形成对还原剂敏感的聚集体。经BIAcore 鉴定细胞周质提取物原液,发现活性抗体片段的产量为5-10 µg/l[5]。
在pBAD/Thio-TOPO 中克隆及过量表达scFv57P
     以质粒pscFvHL57P为模版,将编码scFv57P的目的片段基因用PCR扩增。正相引物为(5’- aggtgaaactgctcgag-3’),其中包含了T7 RNA polymerase的增强子和scFv57P 中Vh的起始基因片段(下划线部分)。反相引物为5
’- tgacg
- 3’用来保持原始pscFvHL57P 构建的C端的B10 tag (下划线部分)。扩增产物在N端多出4 个氨基酸,在C 端多出8个氨基酸(在B10 tag之后),这是为了增加了几个不同的单一的酶切位点,简化后继的克隆表达。PCR 过程如下:95℃(1 min) - 43 ℃(1 min) - 72 (2 min), 30个循环。然后根据产品手册中的说明将扩增的目标基因直接嵌入pBAD/ThioTOPO (pany) 质粒载体中,然后转化入TOP10 宿主菌细胞内。在最终scFvHL57P 在N 端与thioredoxin (Trx) 融合在一起(Fig. 1B) 并包括一个源于pscFvHL57P 的B10 tag,V5 tag,GKPIPNPLLGLDST 和在C 端的一个源于pBAD/Thio-TOPO 的6*His 的tag。阳性克隆通过检测过量表达产物的分子量来确定,对应