《生物化学》实验讲义.doc

实验一蛋白质及氨基酸的颜色反应
一、目的意义
1、学****几种鉴定氨基酸与蛋白质的一般方法及其原理。
2、学****和了解一些鉴定蛋白质的特殊颜色反应及其原理。
二、实验原理
1、双缩脲反应
当尿素加热到180℃左右时,2分子尿素发生缩合放出1分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的紫红色化合物,这一呈色反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中含有多个与双缩脲相似的键,因此也具有双缩脲的颜色反应。借此可以鉴定蛋白质的存在或测定其含量。应当指出,双缩脲反应并非蛋白质的特异颜色反应,因为凡含有肽键的物质并不都是蛋白质。
2、茚三***反应
蛋白质与茚三***共热,产生蓝紫色化合物,此反应为一切蛋白质及α-氨基酸(除脯氨酸和羟脯氨酸)所共有。含有氨基酸的其他化合物也呈此反应。
该反应十分灵敏,1:1500000浓度的氨基酸水溶液就能呈现反应。因此,此反应广泛用于氨基酸的定量测定。
3、黄色反应
含有苯环侧链的(特别是含酪氨酸)蛋白质溶液与***共热时,呈黄色(硝基化合物),再加碱则变为橙黄色,此反应也称为黄蛋白反应。
三、仪器与试剂
1、试剂
(1) 蛋白质溶液:取10mL鸡蛋清,用蒸馏水稀释至100mL,搅拌均匀后用纱布过滤得上清液。
(2) %色氨酸溶液、%酪氨酸溶液、%脯氨酸溶液、%甘氨酸溶液、%苯酚溶液。
(3) %茚三***-乙醇溶液:***,溶于100mL 95%乙醇。
(4) 10%NaOH溶液、1%硫酸铜溶液、尿素、浓***。
2、仪器:试管及试管夹、酒精灯。
四、操作方法
1、双缩脲反应
(1) 取一支干燥试管,加入少量尿素,用微火加热使之熔化,待熔化的尿素开始变硬时停止加热。此时,尿素已缩合为双缩脲并放出氨气(可由气味辨别)。待试管冷却,加入约1mL10%NaOH溶液,振荡使其溶解,再加入1滴1%硫酸铜溶液。混匀后观察出现的粉红色。
(2) 另取1支试管,加入1mL蛋白质溶液,再加入2mL 10%NaOH溶液摇匀,然后再加入2滴1%的硫酸铜溶液。摇匀观察其颜色变化。
(3) 注意事项
加入的硫酸铜不可过量,否则会产生蓝色的氢氧化铜,从而掩盖了双缩脲反应的粉红色。
(4) 记载上述实验过程和结果,并解释现象。
2、茚三***反应
(1) 取3支试管,分别加入蛋白质溶液、%脯氨酸溶液、%甘氨酸溶液各1mL, %茚三***-乙醇溶液,混匀后在小火上加热煮沸1-2min,放置冷却,观察颜色变化。
(2) %脯氨酸溶液、%甘氨酸溶液,%茚三***-乙醇溶液,在微火旁烘干显色,观察斑点出现及其颜色。
(3) 记载上述实验过程和结果,并解释现象。
3、黄色反应
向6个试管中按下表加试剂,观察现象并记录。
管号
1
2
3
4
5
6
材料
蛋白质溶液
指甲
头发
%苯酚
%色氨酸
%酪氨酸
加入量(滴)
4
少许
少许
4
4
4
浓***(滴)
2
20
20
4
4
4
酒精灯加热煮沸
现象
逐滴加10%NaOH后现象
实验二蛋白质的沉淀反应
蛋白质是亲水胶体,当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶性盐类后,即自溶液中沉淀析出(浑浊现象),此现象叫蛋白质的沉淀反应。
(一)蛋白质的盐析作用
一、目的意义
了解盐析法及可逆沉淀的原理,学****用盐析法沉淀分离蛋白质。
二、实验原理
盐析现象是指—般蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度下降,故向其溶液中加入中性盐至一定浓度时,蛋白质即自溶液中沉淀析出。盐析作用与两种因素有关:①蛋白质分子被浓盐脱水;②分子所带电荷被中和。
盐溶现象为低盐浓度可使蛋白质的溶解度增加,实验时要加足够量的盐。
蛋白质的盐析作用是可逆过程,用盐析方法沉淀蛋白质时,较少引起蛋白质变性,经透析或用水稀释时又可溶解。
三、仪器与试剂
1、试剂
⑴蛋白质溶液:取10mL鸡蛋清,用蒸馏水稀释至100mL,搅拌均匀后用纱布过滤得上清液。
⑵饱和硫酸铵溶液;
⑶ 10%氢氧化钠溶液;
⑷ 1%硫酸铜溶液。
四、操作方法
1、取蛋白质溶液约2mL于试管中,加入过量的饱和硫酸铵溶液,混匀后静置3分钟则析出沉淀。
(二)重金属盐类沉淀蛋白质
一、目的意义
了解重金属盐类沉淀法的原理,学****用重金属盐类沉淀法沉淀分离蛋白质。
二、实验原理
溶液pH在蛋白质等电点以上时,重金属盐类(如Pb2+、Cu2+、Hg2+及Ag+等)易与蛋白质结合成不溶性盐而沉淀。
重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全,故常用重金属盐除去液体中的蛋白质。但应注意,