软骨组织工程的基础和临床应用分析.docx

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Abbreviation
HCC Human costal chondrocytes
HAC Human auricular chondrocytes
TEM Transmission electron microscope
FBS Fetal bovine serlllll
PBS Phosphate buffered saline
GAG Glycosaminoglycan
TGF—B1 Transforming growth factor—betal bFGF Basic fibroblast growth factor
IGF Insuline-like growth factor
RARs Retinoic acid receptors
DAB Diaminobenzidine
DMS0 Dimethyl sulfoxide
ECM Extracellulat"matrix
HMG High mobility group
Reverse transcriptase polymerase chain reaction
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软骨组织工程的基础和临床应用研究
中文摘要
【目的]从细胞、分子和基因水平研究探讨人体不同类型软骨细胞(弹性软骨和透明软骨)的体外生长代谢规律,特别是软骨细胞功能老化及相关基因的改变,并以此为基础在人体内构建组织工程软骨以证实软骨组织工程技术在人体内的可行性。
【方法】细胞来源于小耳畸形病人残余耳软骨和雕刻耳软骨支架后多余肋软骨碎片,实验分3部分,第一部分:通过细胞计数,倒置相差显微镜观察,阿利新兰法,免疫组化,RT—PCR比较人耳(弹性软骨)、肋软骨(透明软骨)细胞的体外获得率及原代至第5代的细胞增殖,细胞形态和细胞外基质分泌的不同之处,研究人软骨细胞体外生长代谢及功能老化规律。第二部分:在以上研究基础上,取第一代及第四代人肋软骨细胞采用DNA微阵矩分析人软骨细胞体外老化过程中基因表达水平的变化。
第三部分:以体外培养功能良好的耳或肋软骨细胞,按细胞浓度50
X 104/ml和30%Pluronic-F127/Ham’sF-12混匀注入人耳后皮下或耳屏部位,记录注射量。3-6个月后在小耳畸形病人二期手术时部分取材,进行大体观察,组织块透射电子显微镜检查,组织学染色,及 II胶原免疫组化染色,对再生的软骨组织进行评价。[结果】第~部分:不同类型的人软骨细胞比较:;细胞形态上两者均随老化向类成纤维样形态转化,耳软骨细胞在第三代而肋软骨在第四代大部分转变为类成纤维样长梭形;两类细胞增殖能力随细胞老化丽下降;在糖***多糖(GAGs)的表达水平上肋软骨细胞每代的GAGs含量均高于耳软骨细胞,两者间有显著性差异(P<),但两者均随细胞的传代而减少,下降趋势具有显著相关性(P<),在第四代后处于较低
水平;软骨细胞特征性表型II胶原在蛋白水平定性观察人肋软骨第4
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上海第二医科大学99级硕士研究生毕业论文
代II型胶原表达不稳定,第5代II型胶原染色阴性,而耳软骨第3代起II型胶原表达不稳定,第4代II型胶原染色阴性:通过RT·PCR半定量在mRNA水平上分析细胞外基质I、II型胶原和Aggrecan的表达,肋软骨细胞从第3代起II型前胶原表达明显下降(P<)至第5 代基本消失。而I型前胶原从第3代起表达明显增加(P<)。 Aggrecan的表达在第l代至第3代表达水平较高,无显著性差异fP
第二部分:DNA微阵矩结果显示第1代与第4代软骨细胞基因表达存在差异的共36个基因,大致分为四类:细胞中蛋白及酶类,细胞因子类,转录因子类及细胞增殖分裂和凋亡相关因子。其中在第4 代中表达较低的共11个基因,主要为细胞外基质,生长因子,及转录因子类,而在第4代中表达较高的共25个基因,主要为蛋白酶类, 炎症因子及凋亡相关基因。
第三部分:在小耳畸形耳再造二期手术修整时,组织工程软骨部分取材,组织学上及透射电镜扫描证实与正常软骨组织非常接近。II 型胶原免疫组化染色阳性。
[结论】人肋软骨细胞体外培养3代,平均扩增1 ,,软骨细胞在表型特征(II型胶原表达)及代谢功能上(细胞外基质分泌)均能维持较佳状态,可作为组织工程化软骨构建的种子细胞。在软骨细胞老化过程中,细胞形态向类成纤维样形态转化,细胞表型发生去分化,细胞增殖力下降, 细胞外基质合成减少而基质降解增加。同时证实应用组织工程技术
能在人体内构建出软骨组织