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一、核酸的变性二、核酸的复性
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DNA的变性(denaturation)与复性
DNA变性:水溶液中,双股DNA分子在某些理化因素作用下,双螺旋结构中的碱基堆积力和碱基对之间的氢键受到破坏,严密的双股螺旋变为两条单一的随机卷曲的多核苷酸链,这种现象称为DNA的变性
碱基堆积力(P74/92 ):指在DNA双螺旋结构中,碱基对平面垂直于中心轴,层叠于双螺旋的内侧,相邻疏水性碱基在旋进中彼此堆积在一起相互吸引形成的作用力。
这种力与氢键共同维系着DNA双螺旋结构的稳定性,但相比之下比氢键更重要。
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DNA变性的本质是氢键的断裂,并不涉及磷酸二酯键的断裂,一级结构(碱基顺序)保持不变。
引起DNA变性的因素:
热变性:
酸碱变性(pH小于4或大于11):
变性剂(尿素、盐酸胍、酰***及某些有机溶剂如乙醇、***甲醛等)
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DNA变性后理化性质发生一系列变化
生物活性丧失
粘度下降
比旋度下降
浮力密度升高
酸碱滴定曲线改变
OD260增高
DNA变性的特点:爆发式的,即变性发生在一个很窄的条件变化范围内。
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例:变性引起紫外吸收值的改变
DNA的紫外吸收光谱
增色效应或高色效应: DNA变性后,DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应
不同来源DNA的变化不一,如大肠杆菌DNA经热变性后,其OD260nm可增加40%以上,其它不同来源的DNA溶液的增值范围大多在20-30%之间
而RNA变性后,%。
利用紫外吸收的变化,可以跟踪核酸变性的情况。
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DNA的热变性
通过加热使 DNA分子发生变性. 随着双链的解开,这种变化称螺旋→线团转换。这种转换在一个较窄的温度范围内完成。
DNA紫外吸收随变性程度增加而升高的现象称增色效应。DNA的紫外吸收随温度变化的曲线称解链曲线。
Tm:变性从开始到完全解链,在一个相当窄温度范围内完成,其中点对应的温度(双链解开50%时的温度)称作熔解温度或解链温度。
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7
不同DNA分子具有各自的特征熔解温度Tm
影响Tm的因素有:
①G-C的相对含量:P93
Tm = + +C
(G+C:)
②溶液的离子强度介质离子强度低,Tm低。引申:DNA常保存在1mol/LNaCI溶液中
③溶液的pH 高pH下碱基广泛去质子而丧失形成氢键的能力,Tm值较低。
④变性剂如甲酰***、尿素、甲醛等破坏氢键,妨碍碱基堆积,使Tm下降。
⑤ DNA的均一性:DNA的组成越均一,变性发生在越小的温度范围内;
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DNA的复性
变性DNA在适当的条件下(需缓慢冷却),两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构,这一过程称为复性(或退火)
DNA复性后,一系列性质将得到恢复,但是生物活性一般只能得到部分的恢复。
核酸复性后的紫外吸收降低,即减色效应。
复性过程经成核和拉链式沿伸配对两个阶段。
DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。
将热变性的DNA骤然冷却至低温时,DNA不可能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时,可以复性。
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DNA复性
复性过程中的碱基配对
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影响复性速度的因素:
(5)单链片段浓度
(1)单链片段的大小
(2)片段内重复序列的多少
(3)溶液离子强度的大小
(4)溶液温度的高低(T – 25℃)
复性过程:符合二级反应动力学:复性速率可用
ν=-dc/dt=kc2 变化后可得: 1/k= Cot1/2
Cot1/2可用来衡量DNA复性的速度,同时反应了DNA的复杂程度
浓度大,复性快
片断大,复性慢
重复序列多,复性快
离子强度大,复性快
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