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生物发光和化学发光在生物技术中的应用
最近的一些分子生物学进展使得一些生物技术工具极大提高了生物发光和化学发光的检测和快速应用。这些发展方便了体外和体内持续检测生物过程(如基因表达,蛋白质-蛋白质相互间作用和疾病的进程),可应用于临床、诊断、和药物开发等。而且,结合发光酶或某些在基因水平有生物特异结合位点的发光蛋白发展了超敏感和选择性的生物分析工具,如重组细胞生物传感器,免疫分析和核酸杂交系统。发光分析信号的高度可侦测性使得它非常适合于微小化的生物分析装置(如微矩阵,微流设备和高密度的微孔板)以用于小量样品体积的基因和蛋白的高通量筛选。
自从20多年前,Marlene DeLuca’s第一个成功的获得表达萤火虫荧光素酶基因(luc基因)的转基因烟草以来,生物发光的应用进入了一个新时代。生物发光和化学发光(BL/CL)的主要特点就在于发光信号的高度可测性,可以用PMT(光电倍增管)和CCD成像系统来检测极少量的光子信号。BL是属于CL范畴之内,CL反应的特点是高光子产生效率,BL为05- ,-。因此BL/CL的检测极限可以达到10-18到10-21摩尔,这显然要比其它的光学技术强的多。
BL/CL已经发展出了很多具体的分析方法来诊断目前微摩尔或纳摩尔级的生物样本。通过BL/CL结合酶反应,如氧化酶、脱氢酶和激酶等,就可以达到如此的检测灵敏度。然而,以发光技术为基础的分析主要还仅仅停留在作为一个诊断工具。如果BL/CL的潜能能够得到开发,那么许多稀有的微量样品也可以通过一个便宜、可靠甚至是点对点的方式进行测量。
分子生物学和生物技术持续地进展产生了一些新的BL/CL试剂,包括重组和突变酶及相关基因,可以作为报告剂或探针。这些工具的获得,再加上新的CL高效底物,促进了革新性的生物分析技术的出现,用于许多靶标的超敏感检测。
 
新的BL/CL生物技术工具
新的BL/CL报告基因
报告基因技术代表了分子生物学最近主要的进展之一。报告基因是一段DNA序列,编码一个很容易被侦测到的蛋白或酶。它们可以人工引入到一个细胞内来监测基因的表达,以得到整体细胞生物传感器或细胞定位的作用。报告基因技术应用到研发BL/CL全细胞生物传感器的原理如图1a。
目前,细菌荧光素酶基因(如陆上的Photorhabdus luminescens和海洋中Vibrio harveyi细菌的lux基因),真核的来自于萤火虫Photinus pyralis和海参Renilla reniformis的luc和ruc基因是广泛应用的BL报告基因。此外,一些新的基因cDNAs也已克隆和表达。有意思的是一些新的基因,如那些能够发射红光和绿光的Phrixothrix hirtus荧光素酶,各种突变的发不同波长光的萤火虫荧光素酶。不同的荧光素酶的特性如表1。此外最近克隆和纯化的重组辣根过氧化物酶(
HRP)成为一个新的生物技术工具,在不久的将来有较大的期待。实际上,高效的HRP的底物已经商业化。HRP是与CL检测组合应用最广泛的酶之一。
 
双报告基因系统
在多重发光测试中,信号是同时产生,测试是独立进行。可以测试不同的发光动力学反应或不同的发射光波。可选择的是,反应也可以按顺序被促发,如商业化的Promega公司提供的Renilla和Firefly荧光