半薄超薄切片技术.pptx

背景:
肉眼
光学显微镜
透射电镜
分辨率

µm

应用范围
可观察头发丝、双面刀刀刃的厚度
可观察细胞的结构
(最大有效倍数:1000)
可观察细胞内的结构,分辨DNA、蛋白质等生物大分子、单个金属原子(放大倍数可达百万倍)
观察半薄切片
观察超薄切片
半薄切片
超薄切片
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一、超薄切片技术介绍
固定地好
渗透包埋地好
切地好
载网膜做地好
染地好
超薄切片的基本要求:
超薄切片主要步骤
★取材
★固定
★漂洗、脱水
★渗透、包埋
★超薄切片
★超薄切片染色
每一步都是关键,任何环节的疏忽都会导致制片的失败
1 取材
取材的基本要求 
(1)动作迅速,取材后快速放入固定液中;
(2)体积要小,一般1㎜3,如果来不及,例如野外取材,也可将组织修成(1×1×2)mm大小长条形,之后再进行分割。
(3)减小损伤,切割器械锋利,操作轻,避免牵拉、挫伤与挤压组织。
(4)低温操作,最好在低温(0℃~4℃)下进行,降低酶的活性。所用器具和固定液都应预冷。
(5)取材部位要准确。
取材方法
材料放在洁净的韧性较大的纸上
滴上预冷的固定液
用刀片将组织切下并修小
用牙签或镊子将组织块移至盛有预冷的固定液的小瓶中。
植物材料的取材可以先切成薄片,经适当固定后再切成小方块继续固定。
2 固定(抽气)
 固定的目的
︾采用物理、化学等方法迅速杀死细胞的过程称之为固定。
︾目的是尽可能使细胞中的各种细胞器以及大分子结构保持生活状态,牢固地固定在它们原来所在的位置上,不发生位移。
︾良好的固定是获得精细结构的形态学图象的关键。
常用固定剂
(1)四氧化锇(OsO4)-- OSMIUM TETRAOXIDE
※强氧化剂,与氮原子有较强的亲和力,可较好的固定脂肪、蛋白质、磷酸脂蛋白;
※固定变性DNA及核蛋白,不能固定天然DNA、RNA及糖原;
※具有固定和电子染色双重作用,样品图象反差较好;
▼酶的钝化剂,不适合细胞化学的固定;
▼与乙醇/醛类反应生产沉淀--漂洗
●分子较大,渗透速度缓慢,但反应迅速,㎜;
●固定时间一般为1-2小时,时间太长易使组织变脆,切片困难;
●锇酸固定液常用浓度:1%-2%;

极易挥发,对粘膜、角膜毒性极大,操作要十分小心!
(2)戊二醛(  C5H8O2)--glutaraldehyde
※有效保存组织细微结构,对蛋白质的固定效果好;
※渗透力强,渗透速度快,较好的固定糖原、核蛋白、微管、内质网和细胞基质、有丝分裂的纺锤丝及胞饮小泡等;
※保存某些酶的活力,较好保存抗原,适于细胞化学研究;
※对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强,均匀固定深度:~1mm ,0-4℃可长时间固定(几周甚至1~2个月)不会使组织变脆,可用于远离实验室的取材;
▼缺点:不能保存脂肪,磷脂固定效果差,对细胞膜的显示较差,没有电子染色作用。