[优秀论文]幽门螺杆菌空泡毒素致病的分子机制研究.pdf

上海第二医科大学
博士学位论文
幽门螺杆菌空泡毒素致病的分子机制研究
姓名:袁建平
申请学位级别:博士
专业:病原生物学
指导教师:童善庆

幽门螺杆菌空泡毒素致病的分子机制研究R幽门螺杆菌且恢指锢家跣晕⑿柩蹙ň佑谖刚衬ぃ涑中前体毒素,经过加工形成墒於舅亍6杂赩饔没频难芯坷年,直至今天,诱导细胞内空泡形成及其他效应的机制仍不十分明确。合并通过胞吞作用进入细胞,在细胞质中毒素或其片段作用于某一未知靶分子,这仍是一个假设,与靶分子的作用过程及信号转导途径对人们来说都还是未知的。要深入研究由作用导致的宿主细胞的各种生物学改变,一个有效失败告终。直到今年四月,虲报道了他们成功地在大肠杆菌中表;:T诒狙芯恐校颐枪菇吮泶颲脑嗽靥澹诖蟪Ω司结果表明,转染了该载体的细胞可以发生空泡化,而无须受体结合与膜转感染与慢性萎缩性胃炎、消化性溃疡、胃癌以及胃淋巴瘤的发生密切相关。是由畃虏≈瓴囊恢窒赴舅兀蓈虮嗦氩氖热嗽岢龅贾孪赴张莼囊桓黾偕瑁篤胂赴砻嫣匾煨允芴褰使其在细胞内吞途径的晚期砥谀谔澹叭苊柑迩皇调节膜的转运功能。但的手段是分析在病原或毒力因子作用下宿主细胞基因表达的变化。等人的最新研究表明,胃上皮细胞泶锏母谋洳斡肓薞盏嫉南赴泡化过程,进一步证明宿主细胞基因表达的改变在各种毒力因子致病过程中发挥作用R虼耍疚的目的就是利用作为单一毒力成分的蛋白作用于宿主细胞,研究细胞的应答,以揭示导致宿主细胞病变的分子机制。为了达到这一目的,首先考虑的是在大肠杆菌中表达蛋白。在过去的几年旱,许多研究小组试图通过这一方法得到具有完整活性的毒素蛋白,却均以表达成熟毒素蛋白,甈缬鞠允荆诒湫蕴跫拢玫鞍琢呀馕们又设计构建了的真核表达载体,使蛋白直接在宿主细胞的胞浆内表达。;达有完整活性的和礁銎危崾玖礁銎沃涞牧岷艽嗳酰菀妆淮蚨稀R虼耍博士研究生:袁建平导师:..海带二医科大学博卜学位论文业矬、
酸酶得以维持其活性,同时肌球蛋白轻链激酶表达下调,运的过程。但是,发生空泡化细胞的比例仅%,而且在转染后拍芗娇使我们必须设计一个更好的方案来解决这一问题。我们的设想是构建一个样,就为将来比较幽门螺杆菌吧旰蚔M槐渲甑亩玖Φ於嘶中构建了用于同源重组的含卡那霉素耐受基因的克隆,通过电穿孔转化拿怕莞司鶱。在含有卡那霉素的选择性培养基上挑取克隆,扩增并抽取ü齈和庑蛑な”,序列号为胞,利用表达谱芯片技术分析宿主细胞的差异表达基因。我们首先采用的细胞系化。在不同时间段均有超过龌騧泶锔谋洹8菟窃谥虏」以往研究订实,对细胞骨架的破坏是造成细胞空泡化以及细胞结构完整性和上皮屏障功能丧失的重要原因。因此,有必要研究导致细胞骨架损伤的分子生物学机制。本研究发现,个差异表达基因与细胞骨架有关,大多数表现为下调。肌动蛋白或与肌动蛋白相互作用的蛋白其表达下调。一个复杂的信号转只网络参与了对肌动蛋白细胞骨架的破坏。例如,活化的喙丶っ和萎缩性肌强直激酶相关的岷霞っ表达降低可使鸹睿⒂隦相关激酶分离。肌球蛋白轻链磷泡化现象,这可能是由于转染效率较低所致。这样,运用真核表达的方法研究对宿主细胞的作用也遇到阻碍,这迫基因敲除的幽门螺杆菌突变株,它与野生株的唯一区别是基因的缺失。这在本研究中,我们首先在了等位基因的交换。突变菌的液体培养上清作用于胃上皮细胞后,不能导致细胞空泡化,从功能水平证实了基因被敲除。这~人工构建的基因片段已被接受,命名为“在获得幽门螺杆菌。突变株以后,用野生株和突变株分别作用于宿主细是胃癌细胞系直鹪诟腥竞,∈狈治鰉泶锏谋中表现出的不同功能,筛选出一些基因进行分类研究,并用证,细胞培养上清中蛋白表达的改变用な怠,,琾加以验空泡毒素数的分予机制籥。海第二医科火学博宦畚簘囊建、
发生。其它一些下调基因如琇癉是已知的肿瘤抑制基因,作用的赴涞蛲雎实陀谕槐渲昱嘌锨遄饔玫腟细胞,提示然多种肌动蛋白相关的基因表达发生了改变,但野生株或突变株培养上清作用的赴湮⑺康呐帕形廾飨圆钜欤饪赡苁且蛭N⑺康男翁Ц谋涫且个迟缓的过程。然而,的作用导致微管明显破坏,这与微管蛋白和微管结合蛋白基因的表达下调是一致的。这一结果还提示微管的形态学改变比微丝更生物体的许多病理改变源于细胞增生和细胞死亡之间的平衡机制被打破。本研究发现个差异表达基因与细胞周期、细胞死亡和增生有关,其中一些基因表达的改变可能与肿瘤的发生有关。最显著的变化是一些抗凋亡基因和促增生基ü生有关。我们还比较了不同菌株对宿主细胞凋亡的影响,发现,野生株培养上清示可作为一种候选致癌因子,事实上,其中一些基因表达的变化正是通过影响细胞周期导致肿瘤的。在这些差异表达基因中,/芴灞泶锏南调引人注目。以往研究表明,狪疢受体减少使得甀到馐茏瑁庋芴宓慕榈挤⒒悠浯傧赴さ男вΓ⒖赡苡纱说