发酵液中还原糖测定.doc

发酵过程中的还原糖测定
[实验目的]
1、学****和掌握发酵过程中的取样操作。
2、了解还原糖的各种测定方法;掌握DNS法测定的操作方法及注意事项。
[实验原理]
(一)发酵过程中的取样操作
取样操作是发酵过程中在线控制的重要内容;只有通过取样才能对发酵过程中的诸多参数进行测定,以求进一步的控制。
操作要注意动作协调、快速,不能造成发酵罐的污染,严格按照相应程序进行。盛放样品的器皿也要洁净、无菌,以防止对测定结果产生影响。
(二)发酵过程中的还原糖测定
单糖和某些寡糖含有游离的醛基或***基,有还原性,属于还原糖。而多糖和蔗糖等属于非还原性糖;利用多糖能被酸水解为单糖的性质可以通过测定水解后的单糖含量对总糖进行测定。
发酵工艺控制是通过一系列工艺参数来实现的。这些参数中包括物理参数,即温度、压力等。二是化学控制系数,即pH、糖的浓度等;其中糖的浓度是控制发酵过程中的重要参数之一。由于碳源对于发酵过程菌体生长及产物合成都有较大影响。因此,测知发酵过程中还原糖浓度变化,对发酵控制有重要的指导意义。
还原糖的测定方法有很多,一般有菲林试剂法、酶法和DNS法。
A、菲林试剂法
/mL的CuSO4溶液配制而成,二者混合后,立即生成淡蓝色的Cu(OH)2沉淀。Cu(OH)2在加热条件下与醛基反应,被还原成砖红色的Cu2O沉淀,醛基则被氧化为羧基。
利用菲林溶液与还原糖共沸,生成氧化亚铜沉淀的反应,以次***蓝为指示液,以样品或经水解后的样品滴定煮沸的菲林溶液,达到终点时,稍微过量的还原糖将蓝色的次***沉还原为无色,以示终点。根据样品消耗量求得总糖或还原糖的含量。
用菲林试剂鉴定可溶性还原糖时,溶液的颜色变化过程为:浅蓝色→棕色→砖红色(沉淀)。
B、酶法
又称葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法。葡萄糖氧化酶可将葡萄糖氧化成葡萄糖酸并产生过氧化氢,后者与苯酚及安替比林在过氧化物酶作用下生成红色化合物,葡萄糖的浓度与红色深浅成一定比例。
一般可采用葡萄糖测定的试剂盒,测定方法简单、快速
C、DNS法
又称3,5-二硝基水杨酸法。在碱性溶液中,还原糖变为烯二醇,烯二醇可被3,5-二硝基水杨酸氧化为糖酸。加热进一步产生一种棕红色的氨基化合物。在一定浓度范围内,还原糖的量与棕红色物质的深浅成一定比例关系,通过此比例测定还原糖的含量。
三种方法各有不同的应用和使用范围,应根据具体情况选择。例如菲林法容易受青霉素效价及其他还原性物质的干扰且滴定终点不易判断,误差较大;酶法专一性强且结果准确,但成本较高,适宜精确测定;而DNS法则结果准确且操作相对简单;在生产和研究中应用相对更为广泛。
[实验材料]
1、分析试剂
DNS显色剂每1000mlDNS溶液含有酒石酸钾钠 182g,无水亚硫酸钠 3g,氢氧化钠 20g,3,5-二硝基水杨酸 ,重蒸馏酚 4g。配后过滤放置半月后使用。
1%葡萄糖标准溶液:准确称取100mg葡萄糖,用少量蒸馏水溶解后定容至100ml,冰箱保存备用.
10%ZnSO4溶液.
2、器材
分光光度计,定糖管,移液管,容量瓶,烧杯,电炉等。
[方法步骤]
(一)葡萄糖标准曲线的绘制
取9只定糖管(有盖子,且用绳子系住),分别按照下表