血管生成实验步骤-实验方法完善版.docx

无论原发性肿瘤还是继发性肿瘤,一旦生长直径超过1~2 mm,都会有血管生成。这是由于肿瘤细胞自身可分泌多种生长因子,诱导血管生成。多数恶性肿瘤的血管生成密集且生长迅速。因此,血管生成在肿瘤的发展转移过程中起到重要作用,抑制这一过程将能明显阻止肿瘤组织的发展和扩散转移。于是体外的血管生成实验就能很好的模拟肿瘤的血管发生过程,并且适合研究药物对这一过程的影响实验。
 图一  血管生成镜检图
 

 

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图二  实验流程图
(提前将Matrigel融化,铺于ibidi血管生成载玻片的下孔中,待胶凝后,将细胞悬液加入血管生成载玻片上孔中,成管后使用显微镜观察。)
 

  图三   血管生成载玻片纵截面示意图
(Matrigel铺在下孔,细胞铺在Matrigel上,上孔充满培养基)

图四  实验结果收集和分析流程图
(在特定的时间点采集图片,并且进行图像分析(Wimasis全自动分析)测量小管长度,成环数,细胞覆盖面积和结点。之后在对测量结果进行统计分析以说明实验结果。)
 
 

1、准备基质胶
,放入4。C冰箱,使胶能过夜缓慢融化。(注意:同样要准备一些4。C预冷的枪头用于吸取Matrigel)
,将Matrigel始终保持放在冰盒中。
,取出ibidi血管生成载玻片。
 Matrigel。注意枪头要垂直于内孔的正上方加入Matrigel,防止有Matrigel流经上孔而留下残留胶。
由于Matrigel流动性不强,并且有可能移液枪不准确,有可能打入10μl的胶,却不能填满血管生成载玻片的下孔——这样,必然会影响到实验的成像结果。
 
如何判断是否加入了合适体积的Matrigel:
我们只需用一张格子纸就能知道自己的移液枪调整到多少能正好把下孔填满。
如上图所示,垂直透过每个孔看下面的格子纸,如果格子被缩小了,那么就说明胶没加满,格子被放大了,那么胶就加多了,格子没发生什么变形,这才是刚刚加满下孔的状态。
 
2、凝胶
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,放入浸过水的纸巾,制成一个湿盒。
,盖上培养皿盖。
,静置30分钟左右,等待胶凝结。
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3、铺细胞
加入细胞的量直接影响实验结果,所以在正式实验开始之前,要对不同类型的细胞和使用数量进行预实验。获得最佳比例的细胞密度。我们今天的实验使用HUVEC细胞,每孔种10000个细胞即可。
*105cells/ml的细胞悬液,充分混匀。
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,注