基因组编辑技术.ppt

基因组编辑
应用基因编辑技术不长角的奶牛
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基因编辑的定义:
通过精确识别靶细胞DN***段中靶点的核苷酸序列,利用核酸内切酶对DNA靶点序列进行切割,从而完成对靶细胞DNA目的基因片段的精确编辑。
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基因编辑的优势
与传统的以同源重组和胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)技术为基础的基因打靶技术相比,基因编辑新技术保留了可定点修饰的特点,可应用到更多的物种上,效率更高,构建时间更短,成本更低。
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基因编辑原理
现代基因组编辑技术的基本原理是相同的,即借助特异性 DNA 双链断裂( DNA double-strand breaks DSBs) 激活细胞天然的修复机制,包括非同源末端连接( NHEJ)和同源重组修复(HDR) 两条途径。
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第一代: ZFN(锌指核酸酶)
第二代: TALEN(转录激活样效应因子核酸酶)
第三代: CRISPR/Cas9(成簇的规律性间隔的短回文重复序列)
第四代:NgAgo - gDNA 韩春雨
基因编辑发展史
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ZFN 基因组编辑技术
ZFN 技术是第一代基因组编辑技术,其功能的实现是基于具有独特的DNA序列识别的锌指蛋白发展起来的。
1986年Diakun 等首先在真核生物转录因子家族的 DNA 结合区域发现了Cys2- His2锌指模块。
1996年,Kim等首次人工连接了锌指蛋白与核酸内切酶。
2005年,Urnov等发现一对由4个锌指连接而成的ZFN可识别24 bp的特异性序列,由此揭开了ZFN在基因组编辑中的应用。
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ZFN=DNA识别域+核酸内切酶
DNA识别域:
由一系列 Cys2-His2锌指蛋白(zinc-fingers)串联组成(一般3~4个),每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。
核酸内切酶:
非特异性核酸内切酶FokI,形成二聚体时切割双链DNA。
ZFN原理和机制
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ZFN 由锌指蛋白(ZFP)和 FokⅠ核酸内切酶组成。其中,由 ZFP 构成的 DNA 识别域能识别特异位点并与之结合,而由FokⅠ构成的切割域能执行剪切功能,两者结合可使靶位点的双链DNA 断裂(DSB)。于是, 细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同源末端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。HR 修复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰,而 NHEJ 修复极易发生插入突变或缺失突变。两者都可造成移码突变,因此达到基因敲除的目的。
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ZFN 诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种及基因位点,具有较好的发展潜力。
缺点:
(1)以现有的策略设计高亲和性的 ZFN,需要投入大量的工作和时间;(2)在细胞中持续表达 ZFN 对细胞有毒性;(3)虽然三联体设计具有一定特异性,但仍然存在不同程度的脱靶效应。
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TALEN 基因组编辑技术
2009 年,研究者在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)中发现一种转录激活样效应因子(TAL蛋白),它的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系,一个模块单元识别一个碱基,简单且特异性极好。随后,TALE特异识别 DNA 序列的特性被用来取代 ZFN技术中的锌指蛋白。它可设计性更强,不受上下游序列影响,具备比ZFN 更广阔的应用潜力。
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