实验-大肠杆菌感受态细胞的制备及转化ppt课件.ppt

实验二
大肠杆菌感受态细胞的
制备及转化
内容一:大肠杆菌感受态细胞的制备
实验目的
实验原理
实验仪器、材料、试剂
实验步骤
1
2
3
4
注意事项
思考题
5
6
实验目的
掌握感受态细胞的概念及其意义。
掌握感受态细胞的制备原理与操作方法。
实验原理
感受态:受体(或者宿主)最易接受外源DN***段并实现其转化的一种生理状态。它是由受体菌的遗传性状所决定的,同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
制备感受态的细胞一般选择对数生长期,新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。常用的感受态制备方法包括KCl、CaCl2等方法;后者因为操作简便且符合大多数的分子克隆要求,因而被广泛采用。
CaCl2 法的基本原理:
细菌处于低温(0℃)和低渗的CaCl2溶液中,菌体膨胀,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于菌体表面,在42℃进行短时间的热激处理,促进DNA的吸收。
实验原理
CaCl2 法简便易行,用 CaCl2法制备的感受态细胞,可使每微克超螺旋质粒 DNA产生5106-2107个转化菌落。在实际工作中,每微克有105以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。
制备出的感受态细胞暂时不用时,加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃,可以保存半年。
实验原理
3、试剂的质量:所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的,并用超纯水配制,并用微孔滤膜过滤灭菌,最好分装保存于干燥的冷暗处。
实验原理
4、防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
实验原理