海润德饲用微生物菌种的16SrDNA分子鉴定技术路线.doc

海润德饲用微生物菌种的16SrDNA分子鉴定技术路线
一、海润德饲用微生物菌种的16SrDNA分子鉴定技术路线
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提取分离菌株基因组DNA
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以细菌基因组DNA为模板,P1、P2为引物,PCR扩增其16SrRNA
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PCR产物切胶回收
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连接PMD18T-vector
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转化Ecoli DH5а;蓝白斑初筛、PCR、酶切鉴定重组质粒
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将鉴定正确的重组质粒,送交测序
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测序结果在NCBI上BLAST分析
二、试验方法
1、细菌基因组提取方法
方法一:细菌基因组简易提取方法(参考国外文献)
        ,12000rpm,,弃上清。
        lysis buffer( 40 mM  Tris-Cl; 20Mm NaAC; 1Mm EDTA; 1%SDS.),剧烈振荡。(移液枪反复吹打或者涡漩,目的使菌体充分悬浮)。
        5M NaCl剧烈混合。
        ,10 min 取上清。
        ***仿:异戊醇(24:1),反复颠倒50次混匀.(呈牛奶色)。
        rpm ,10min,取上清。
        ,置-20℃冰箱,沉淀DNA。
        %乙醇漂洗沉淀
        ,风干。
        10 加适量ddH2O溶解DNA。
        -1 ul RNAase,37℃作用20 min 。
        12.-20℃冰箱保存。
方法二:SDS/CTAB法
        ,12000rpm,,弃上清。
        TE缓冲液充分悬浮菌体。
        10%SDS,3μL蛋白酶K,混匀,37
℃,1h.
        100μl NaCL(5M) 混匀。
        ,混匀;65℃ 10min。
        /***仿/异戊醇混合液,混匀。
        ,4-5min
        、7步骤,抽提2-3次
        rpm ,离心10min,取上清。
        ,置-20℃冰箱,沉淀DNA。
        %乙醇漂洗沉淀,可稍加离心。
        。
        。
        -1 ul RNAase,37℃作用20 min 。
        15.-20℃冰箱保存。
2、16S PCR
   (1)反应体系:20ul
10xPCR Buffer(Mg2+):
d NTP:
P1:
P2:
模板:
Easy-Taq:
2ul



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