培训感言.docx

暑期实****感言
吉林农业大学
生命科学学院
生物技术三班
吕悦
实****感言
在这次实****中我们收获颇多,因为我不仅学到了知识,也学到了技术。在这里我感到了快乐与成就,还有朋友的重要性。
实****中我们得到了很多技术。
流程
巢式PCR,或正式PCR。
胶回收技术,得完整片段。
酶切片段,目的基因与载体同时切。
连接,转化。
PCR验证,得阳性结果。
摇匀,提质粒。
PCR酶切,用3步中的酶验证。
测序。
载体构建。
PCR的反应步骤:变性-退火-延伸
实验步骤
RNA提取流程

RNAiso Plus 后匀浆室温静置 5 分钟
,000 g 4℃离心 5 分钟, 上清转移至新的 ml tube 中
1/5 RNAiso Plus 体积量的***仿
5 分钟
,000 g 4℃离心 15 分钟将上清液转移至新的离心管中
10 分钟
,000 g 4℃离心 10 分钟向沉淀中加入 1 ml 的 75%乙醇清洗沉淀
,000 g 4℃离心 5 分钟弃上清保留沉淀
DEPC 处理水中
二)第一链CDNA合成
,按以下顺序。
1)模板总RNA 10ng-5ng 或poly(a)RNA 1ng--
2)引物 oligo(dt)(100pmol) (100pmol) 基因特异性引物15-20pmol
3)DEPC-
。
。
1)Total RNA/mRNA 50 ng-5 μg/5-500 ng
2)Anchored Oligo(dT)18( µg /µl) 1 µl
3)or Random Primer(N9)( μg/μl) 1µl
4)or GSP 2 pmol
5)2×ES Reaction Mix 10 μl
6)EasyScript RT/RI Enzyme Mix 1 μ
7)RNase-free Water to 20µ
4、轻轻混匀
如用Anchored Oligo(dT)18 或基因特异引物(GSP),42°C孵育30 min。
如用Random primer,25°C孵育10 min,42°C 孵育30 min。
5、85°C加热5 min失活EasyScript RT。
三)胶回收
在含合适抗生素的培养基中接种目标菌株,于 37℃摇床充分振荡培养 12-16 h。
菌液状态对质粒得率非常关键,请用不超过容器容量 1/4 体积的培养基进行培养。

处于生长平台期的菌体用于质粒抽提得率最高,过度培养可能导致 DNA 降解。
,取 -5 ml 菌液,于室温,8,000 × g 离心2 min 收集菌体, 倒尽或吸干培养基。
※对于高拷贝质粒,从 5 ml 过夜菌液中通常可以获得超过 20 μg 质粒 DNA,不推荐使用更大的菌液量。
※对于低拷贝质粒,如果使用更多的菌液,则同