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七年制碱性磷酸酶的动力学分析.ppt
文档介绍:
碱性磷酸酶 的动力学分析
酶促反应动力学:研究各种因素对酶促反应速率的影响,并加以定量的阐述。
影响因素包括:酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。
碱性磷酸酶 米氏常数的测定
原理
米氏常数是酶促反应动力学中的一个相当重要的常数,通过实验,可理解并掌握利用实验求出Km的方法。
在酶促反应中,当反应体系的温度、 pH及酶浓度恒定时,底物浓度对反应速率的影响呈矩形双曲线关系。
米氏方程式:反应速率与底物浓度关系的数学方程式。
[S]:底物浓度
V:不同[S]时的反应速率
Vmax:最大反应速率(maximum velocity)
Km:米氏常数(Michaelis constant)
V
Vmax[S]
Km + [S]
=
──
Vmax
V
[S]
Km
Vmax/2
Km值等于酶促反应速率为最大反应速率一半时的底物浓度,单位是mol/L。
酶底物复合物
E + S
E + P
ES
(过渡态)
Vmax[S]
Km+[S]
V =
(林-贝氏方程)
+
1/V=
Km
Vmax
1/Vmax
1/[S]
两边同取倒数
双倒数作图法
-1/Km
1/Vmax
1/[S]
1/V
本实验以碱性磷酸酶(AKP)为材料,用磷酸苯二钠为其底物。
AKP催化磷酸苯二钠水解产生游离酚和磷酸盐。酚在碱性溶液中与4一氨基安替比林作用,经铁***化钾氧化,可生成红色的醌衍生物。
根据红色的深浅可测出酚的含量,进而算出相应的酶活性(V)。
再根据Lineweaver—Burk法作图,计算其Km值。
操作
底物浓度对酶促反应速度的影响
1)取试管8支,按下表操作(应特别注意准确吸取底物溶液及酶液):
加入酶液立即计时,混匀后置37℃水浴准确保温15min。
2)保温结束,各管立即加入碱性溶液1ml以终止反应。
3)各管中分别加入4-氨基安替比林溶液1ml及0.5%铁***化钾2ml,混匀,放置l0min,以第8管调零点,于510nm波长处比色,测定各管吸光度。
酶促反应速度计算
酶促反应速度以每15分钟所产生酚的微克数(μg /15min)来表示。
根据酚标准曲线查出各管的酚含量,即各管在不同底物浓度下的反应速度。
本实验不制作酚标准曲线,而以1/[S]对1/A作图,因各管吸光度与其酚含量成正比,故可用吸光度代表酶促反应速度。 内容来自淘豆网www.taodocs.com转载请标明出处.