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螺旋讲堂 2010 年第 1 期总第 20 期

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毕赤酵母表达从入门到提高

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写在前面,因为酵母里用到了很多遗传学的命名方法,所以建议大家首先看一下这个资料,可
以让大家理解一些不常见的符号及意义。下载地址如下:
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一、甲醇营养型毕赤酵母表达系统介绍
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是近几年发展起来的较为完善的、被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达
系统。目前通过毕赤酵母表达了很多种性质不同的蛋白,越来越多的实验室及公司开始搭建毕赤酵母表达系统的平台,
相信随着对毕赤酵母表达系统的研究越来越深入,会有更多成功表达并进行商业化应用的案例出现。

1) 具有强有力的乙醇氧化酶(Alochol Oxidase,AOX1)基因启动子,可严格调控外源蛋白的表达;
2) 作为真核表达系统,可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰,从而使表达出的蛋白具有生物活性;
3) 营养要求低、生长快、培养基廉价,便于工业化生产;
4) 可高密度发酵培养,在发酵罐中细胞干重甚至可达 120g/L 以上;
5) 表达量高,许多蛋白可达到 g/L 以上水平;
6) 在 P. pastoris 中表达的蛋白既可存在于细胞内,又可分泌到胞外,自身分泌的蛋白非常少,十分有利于纯化;
7) 糖基化程度低,与 S. cerevisiae 相比,P. pa storis 不产生过度的糖基化。P. pastoris 表达的糖蛋白的糖链长度为
8-14 个甘露糖,而 S. cerevisiae 糖链中甘露糖多达 50-150 个;S. cerevisiae 分泌的糖蛋白的核心寡聚糖具有
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终端α-1,3 糖苷连接,使分泌的糖蛋白的抗原性明显增强,而 的糖基化位点与哺乳类细胞的相同,
其所分泌的糖蛋白的免疫原性较低,更利于临床应用。
2. 毕赤酵母常用的菌株类型
+和Muts
在毕赤酵母基因组中有 2 个醇氧化物酶编码基因,即AOX1 基因和AOX2 基因。菌株利用甲醇的速度主要是依靠AOX1
基因表达的AOX1 蛋白,其醇氧化物酶的活性非常高以至于在有AOX1 酶蛋白存在的情况下可以忽略AOX2 酶蛋白,这就
是甲醇营养型毕赤酵母的两种表型Mut+和Muts产生的原理。当菌株基因组中既有AOX1 基因,也有AOX2 基因时,菌株的
表型为Mut+ 该菌株有甲醇的培养基中仍可以正常生长。当菌株基因组中仅有AOX2 基因时,菌株的表型为Muts,该菌株
在有甲醇的培养基中生长缓慢。
菌株 GS115、KM71 和 SMD1168 的区别
GS115、KM71 和SMD1168 等是用于表达外源蛋白的酵母受体菌。GS115、KM71、SMD1168 是组氨酸缺陷型,
如果表达载体上携带有组氨酸基因,可补偿宿主菌的组氨酸缺陷,因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些
受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于 10-8。GS115 表型为Mut+ 。重组表达载体转化GS115 后,长出的转化
子可能是Mut+,也可能是Muts,可以在MM 和MD 培养基上鉴定表型。SMD1168 和GS115 类似,但SMD1168 是蛋白
酶缺陷型,可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用。KM71 没有AOX1 基因,本身就是Muts。因此转化后所有的转化子都
是Muts,不必鉴定表型。
3. 毕赤酵母菌株的生长
毕赤酵母适宜的生长温度是 28 至 30 度,温度超过 32 度对蛋白的表达是有害的,并可能导致细胞的死亡。关于毕赤
酵母的生长速度:
„ 在YPD培养基中,不论是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为 2h
„ Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的
„ 存在甲醇的情况下,Mut+在对数期增殖一倍的时