人ftl基因的克隆、表达纯化及其多克隆抗体的制备.pdf

郑州大学
硕士学位论文
人FTL基因的克隆、表达纯化及其多克隆抗体的制备
姓名:金蕾
申请学位级别:硕士
专业:劳动卫生与环境卫生学
指导教师:吴逸明;吴卫东
20070526
人���虻目寺⒈泶锎炕�捌涠嗫寺】固宓闹票�中文摘要硕士研究生指导老师吴逸明教授吴卫东教授郑州大学公共卫生学院劳动卫生学教研室郑州���金蕾肺癌是目前全世界最常见的呼吸系统恶性肿瘤,近些年来其发病率和死亡率呈逐年上升趋势,已成为严重威胁人类健康的疾病之一。寻找理想的表型生物标志物,阐明肺癌发生发展过程中起关键作用的分子,以用于肺癌的早期检测诊断及预后评估一直是肺癌研究领域的热点和难点。目前临床上常用的肺癌血清标志物指标缺乏对肺癌诊断的特异性,敏感性也较低,不能实现对肺癌的早期准确诊断,从而对提高肺癌患者生存质量、延长寿命意义并不大,因此寻找提高肺癌早期诊断率的高效特异性标志物不仅具有重要临床价值,也势在必行。研究已发现,多种基因的异常表达与肺癌的发生、发展关系重大。铁蛋白轻链���現��褪瞧渲幸恢郑��翘�鞍椎囊恢盅腔�L�鞍������且恢�普遍存在于生物体内的保守性较高的多功能多亚基生物蛋白,是细胞内主要的铁储存蛋白。在体内,铁蛋白的主要生理功能是储存机体中的过剩铁,避免产生铁中毒和释放铁给需铁的细胞,用于体内生物合成含铁的蛋白质或酶。铁作为一种过渡金属元素其离子可以通过���反应促进电子转移、活化氧化还原反应,并由此产生大量氧自由基����后者攻击生物大分子使其变性,使机体生物膜中不饱和脂肪酸发生过氧化而损害膜功能,从而引发广泛损伤。氧自由基还活化聚��.核糖合成酶,促进核蛋白的聚.���核糖化,从而使染色质折叠收缩成有丝分裂期的染色体,线粒体、内质网损伤使钙外流,导致胞浆钙离子浓度剧升,钙离子作为生物信使,可活化众多的酶,促使胞浆中各种成分亦同步进入有丝分裂状态,从而加速细胞的分裂增殖,这最终将促进癌变的发生。因此铁蛋白可以通过保护机体免受氧化损伤而在肿瘤的发生中起着重要的抑制作用。铁蛋白含有�植煌�难腔��直鹞8卧嘈���和心脏型�型��渤莆G崃础啊������和重链�~�,���。铁蛋白�腔�胫琢鲋�涔叵档难芯恳延泻芏啵�阎な盗怂��肿瘤发生过程中起着重要的促进作用。而与之具有�%序列同源性的铁蛋白��欠窬������嫠捌厶堂亟±芏位控奎生塞撼暮���
实验方法:有类似作用,这个问题也开始引起一些研究人员的重视。目前,在对多种肿瘤的研究中都发现有��腔�囊斐1泶铮�绺伟�⑽赴┑取1�课题组前期运用比较蛋白质组学技术也发现���蛟诜伟┳橹�写嬖谝斐1泶铮�崾�该蛋白可能在肺癌的发生发展中起着重要作用。本研究运用���技术从人肺癌组织中获取人���虻膃��蛄校��淅┰�产物���虿迦氲皆�吮泶镌靥錺�����校�;�氪蟪Ω司鶭��中,通过电泳条带比对、��┰觥⒌ニ�盖蟹治黾靶蛄胁舛ǖ确椒ǘ灾刈橹柿���“�.���行鉴定,将测序正确的含有目的基因的重组子转化到大肠杆菌��中,鉴定后,用��对重组子�����瓼���杏盏急泶铮�呕�泶锾跫��怪�咝П泶锶诤系鞍祝�泶�产物用镍树脂亲和层析法纯化。通过将纯化产物免疫日本大耳白兔,获得抗��亩嗫�隆抗体,为开展��分子后续功能的研究及寻找到肺癌特异性抗原提供了重要前提。本研究旨在建立体外高效表达��姆椒ǎ�竦么慷冉细叩腇�蛋白,免疫动物后获得其多克隆抗体,为进一步研究其在肺癌发生、发展中的生物学功能奠定基础。��躌�的制备及���方法扩增����用���一步法提取���肁�以随机引物把��孀B嘉猚���僖詂��为模板,用���虻纳舷掠翁匾煨砸�锖虳�����������蠵�扩增,扩增产物用�甇%琼脂糖凝胶电泳初步鉴定。通过�半定量方法分析��癌组织中的表达情况,并与自身癌周组织进行比较。��康幕�蛴氡泶镌靥宓牧�印⒆;�爸刈樽拥募��将扩增的���蛴氡泶镌靥錺�����凑蘸鲜实谋壤�旌希�尤隩�酶,在�℃恒温连接仪中连接过夜,将上述连接产物转化大肠杆菌����粜钥寺⊥�过观察转化平板上菌落生长状况初步判定。挑取可疑菌落培养,小提质粒后通过单、双酶切����、特异��┰黾安庑蚪�徊郊�āD康幕�虻男蛄胁舛ㄓ杀本�三博远志生物技术公司完成,通过���治鋈砑�ú庑蚪峁�隚����泄ú嫉�已知序列进行分析和比较。‘将测序正确的含有目的基因的重组子转化到大肠杆菌��中,对转化结果进行鉴�瓼�融合蛋白的诱导表达、可溶性分析及纯化将鉴定正确的重组质粒经不同浓度的��诱导,收集不同诱导时问的菌液,变性��在肺������刈橹柿W;疊��凹��定,方法同上。嫠捌盍堂亟±堂丝监奎���生塞摘要�
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